O presente protocolo descreve a ultrassonografia de alta frequência para visualização de toda a glândula tireoide de camundongos e monitoramento do crescimento do carcinoma anaplásico de tireoide.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Ultrassonografia de Alta Resolução na Análise de Tumores Ortotópicos ATC em Modelo de Camundongo Geneticamente Modificado
Neste artigo
Resumo
Resumo
O carcinoma anaplásico de tireoide (CTA) está associado a um prognóstico ruim e curto tempo médio de sobrevida, mas nenhum tratamento efetivo melhora significativamente os desfechos. Modelos murinos geneticamente modificados que imitam a progressão do ATC podem ajudar os pesquisadores a estudar tratamentos para essa doença. Cruzamento de três genótipos diferentes de camundongos, um TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; O modelo de ATC transgênico Trp53Δex2-10/Δex2-10 foi desenvolvido. O modelo murino ATC foi induzido por uma injeção intraperitoneal de tamoxifeno com superexpressão de BrafV600E e deleção de Trp53, e os tumores foram gerados em cerca de 1 mês. A ultrassonografia de alta resolução foi aplicada para investigar a iniciação e progressão do tumor, e a curva dinâmica de crescimento foi obtida medindo-se o tamanho do tumor. Comparada à ressonância magnética (RM) e à tomografia computadorizada, a ultrassonografia apresenta vantagens na observação do modelo murino ATC, como ser não invasiva, portátil, em tempo real e sem exposição à radiação. O ultrassom de alta resolução é adequado para medições dinâmicas e múltiplas. No entanto, o exame ultrassonográfico da tireoide em camundongos requer conhecimento anatômico e experiência relevantes. Este artigo fornece um procedimento detalhado para a utilização de ultrassom de alta resolução para varrer tumores no modelo ATC transgênico. Enquanto isso, o ajuste de parâmetros ultrassônicos, habilidades de varredura de ultrassom, anestesia e recuperação dos animais e outros elementos que precisam de atenção durante o processo são listados.
Introdução
Embora o carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) seja responsável por menos de 2% dos cânceres de tireoide, ele causa mais de 50% das mortes relacionadas ao câncer de tireoide anualmente. O tempo mediano de sobrevida após o diagnóstico de ATC é de apenas cerca de 6 meses, e não há tratamentos disponíveis que melhorem significativamente a sobrevida 1,2.
A raridade do ATC tem dificultado a pesquisa que estuda como a doença começa e progride agressivamente. Recentemente, foram disponibilizados modelos de camundongos geneticamente modificados que mimetizam a doença, os quais fornecem informações sobre a doença e suas respostas a possíveis tratamentos 3,4,5. Tais estudos requerem imagens tumorais precisas para medidas e monitoramento, que geralmente são realizados por ressonância magnética, tomografia computadorizada ou ultrassonografia de alta resolução 6,7. A ultrassonografia tem sido amplamente utilizada em órgãos de camundongos. Tem vantagens sobre a ressonância magnética e a tomografia computadorizada, pois pode ser realizada em tempo real, não expõe o indivíduo à radiação, e o equipamento necessário é pequeno o suficiente para serportátil8,9. No entanto, estudos sobre o monitoramento contínuo do crescimento de ATC usando ultrassom são raros; Portanto, este trabalho explora a utilidade do ultrassom nesse contexto.
Aqui, um protocolo para o uso de ultrassonografia de alta resolução para escanear, monitorar e medir tumores com precisão em um modelo de ATC em camundongos é apresentado.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
O presente estudo foi realizado com aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sichuan. TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Camundongos transgênicos Trp53 Δex2-10/Δex2-10 10 foram usados neste estudo (ver Tabela de Materiais). As etapas do protocolo podem ser modificadas para diferentes espécies animais, se necessário. Doze camundongos, incluindo seis fêmeas e seis machos, com idade média de 93 dias, foram utilizados aqui.
1. Preparação experimental
- Ligue o sistema de ultrassonografia (consulte Tabela de Materiais) e crie uma nova pasta para capturar as imagens e coletar os dados. Selecione a sonda de linha de 40 MHz e clique no padrão de tecido superficial para ativar o transdutor de tecido superficial. Use o "modo B" para imagens da tireoide (Figura 1A).
NOTA: O modo B é o modo básico de imagem de ultrassom. A aparência das imagens de ultrassom depende das interações físicas do som com os tecidos do corpo. As imagens modo-B são produzidas na forma de imagens cinza11,12. - Mantenha os ratos em gaiolas específicas com livre acesso a comida e água. Coloque a gaiola num dispositivo de aquecimento suplementar (ver Tabela de Materiais) para garantir a termorregulação.
- Garantir isoflurano suficiente no vaporizador e O2 no tanque. Se os suprimentos forem inadequados, troque os tanques por novos.
- Limpe a plataforma de imagem animal com soro fisiológico estéril e ligue o botão de aquecimento. Verifique se a temperatura é de 38-40 °C antes de colocar o animal na plataforma (Figura 1C).
2. Preparação de animais para exames de imagem
- Ligue o vaporizador de isoflurano. Transfira o mouse da gaiola para a caixa de anestesia.
- Anestesiar o animal utilizando uma mistura de 1%-2% de isoflurano do vaporizador e oxigênio fluindo a 0,8 L/min.
- Aplique o creme depilatório do peito ao pescoço, aguarde 30 segundos e, em seguida, limpe completamente o creme e o pelo. Lave bem a área e os pelos circundantes com soro fisiológico estéril quente.
- Coloque o animal anestesiado sobre a plataforma aquecida. Cobrir o focinho com um cone nasal conectado à saída da anestesia (Figura 2A, B).
NOTA: O mouse deve ser completamente sedado dentro de 1-2 min. Se o animal ainda estiver ativo, realizar indução prolongada de isoflurano até que o animal não apresente mais reflexo de retirada do pedal. Certifique-se de que o animal está respirando de forma estável. - Durante a aquisição de imagens, monitore a frequência cardíaca do mouse através da plataforma aquecida.
NOTA: O sistema de imagem de ultrassonografia está equipado com um monitor de frequência cardíaca. - Utilizar fita adesiva para fixar os membros do rato à plataforma aquecida, com o animal em decúbito dorsal. Certifique-se de que o cone nasal esteja posicionado de forma estável com um fluxo constante de gás anestésico (1,5 L/min).
- Proteja os olhos aplicando pomada oftálmica.
3. Imagem tumoral
- Ajuste o sistema de geração de imagens para otimizar a resolução. Estabeleça os seguintes parâmetros: ganho bidimensional, 25-30 dB; profundidade da imagem, 10 mm; número de zonas focais, 3; e centro, 3-6 mm.
OBS: Para o presente estudo, foi utilizada sonda de 40 MHz. O modo B foi especificado para aquisição dos dados. - Aplique liberalmente gel de ultrassom (ver Tabela de Materiais) na área da pele nua.
- Segure a sonda e coloque-a em contato com o gel de ultrassom no tórax e, em seguida, digitalize do tórax em direção ao pescoço para localizar a tireoide (Figura 2C).
NOTA: Aplique pressão suavemente durante a digitalização; A pressão excessiva no pescoço do animal pode causar respiração ofegante ou apneia. Esse protocolo foi desenvolvido com base no escaneamento manual, mas o escaneamento mecanizado também pode ser realizado usando uma máquina para guiar a sonda, como uma plataforma de imagem animal que se move ao longo dos eixos x e y. - Digitalize para cima e para baixo para identificar os limites do tumor e avaliar seu tamanho e forma.
NOTA: Uma tireoide saudável geralmente aparece como uma estrutura homogênea hipoecogênica na frente da traqueia. Os tumores anaplásicos fazem com que a tireoide pareça muito maior, o que pode ser facilmente identificado pelo exame do pescoço (Figura 3). - Identificar os tumores ATC da traqueia e dos músculos da cinta dependendo da localização anatômica e eco ultrassonográfico.
NOTA: Os músculos da cinta estão localizados na frente da tireoide e traqueia, bem como atrás da tireoide. O eco ultrassonográfico dos músculos da cinta parece maior que o da ATC, enquanto a atenuação existe atrás da traqueia13.- Com base na impressão do tumor total, confirme o corte de imagem com o maior diâmetro tumoral da esquerda para a direita. Pressione o botão de congelamento e meça os diâmetros tumoral anteroposterior e esquerdo-direito usando o paquímetro de ultrassom.
OBS: O diâmetro anteroposterior deve ser medido perpendicularmente ao diâmetro do tumor da esquerda para a direita (Figura 4). O tamanho tumoral da CTA foi calculado multiplicando-se o diâmetro anteroposterior pelo diâmetro tumoralesquerdo-direito14. Como o tamanho dos tumores dos lados esquerdo e direito foi inconsistente, cada lado dos tumores foi calculado separadamente. O tamanho total dos tumores foi obtido pela adição dos tumores bilaterais. Os tamanhos foram registrados para observar a curva de crescimento da CTA.
- Com base na impressão do tumor total, confirme o corte de imagem com o maior diâmetro tumoral da esquerda para a direita. Pressione o botão de congelamento e meça os diâmetros tumoral anteroposterior e esquerdo-direito usando o paquímetro de ultrassom.
- Salve a gravação como um cine loop, o que facilita a revisão das imagens selecionadas.
4. Recuperação de animais
- Após a digitalização, limpe o gel de ultrassom e remova a fita de contenção dos membros do animal.
- Coloque o rato no dispositivo de aquecimento suplementar (passo 1.2). Deite o animal de lado (Figura 2D).
- Depois que o mouse se recuperar (~5 min), transfira-o de volta para a gaiola.
- Limpe o sistema de ultrassonografia, a sonda e a plataforma usando um pano macio e lenços de álcool isopropílico ou glutaraldeído.
- Desligue o sistema de geração de imagens.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O tamanho médio da CTA direita no início do estudo foi de 4,867 mm2, e o tamanho médio da CTA esquerda foi de 5,189mm2. Na quarta medida, o tamanho médio do CTA direito cresceu para 11,844 mm 2, enquanto o tamanho do tumor do lobo esquerdo cresceu para 9,280 mm2. O tamanho total do CTA aumentou de 10,057 mm2 para 15,843mm2. Na etapa posterior do estudo, a CTA cresceu rapidamente. Em relação ao camundongo marcado como "P92" (Tabela 1), o ta...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo utiliza ultrassonografia de alta resolução para analisar tumores ATC ortotópicos em um modelo de camundongo geneticamente modificado. O modelo transgênico, com genótipo TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10, foi desenvolvido em nosso laboratório. Os animais superexpressam BrafV600E e não têm Trp53; A injeção intraperitoneal de tamoxifeno nos animais leva ao crescimento tumoral após aproximadamente 1 mês10. Os tumores cresce...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Esta pesquisa não recebeu nenhuma bolsa específica de agências de fomento públicas, comerciais ou sem fins lucrativos.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fita adesiva | Winner | ||
| Sistema de anestesia | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt camundongos | Colaboração com o Instituto de Ciências da Vida, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Câmara para indução anestésica | RWDlifescience | ||
| Cotonetes | Creme | ||
| Veet | |||
| Manta de aquecimento elétrico | Petbee | ||
| RWDlifescience | |||
| Luvas médicas | Winner | ||
| B914JY | |||
| TPO-cre/ERT2 mouses | Colaboração com o Instituto de Ciências da Vida, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Colaboração com o Instituto de Ciências da Vida, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Gel de ultrassom | Keppler | KL-250 | |
| Máquina de ultrassom | VisualSonics | Vevo 3100 |
Referências
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527(2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731(2017).
- Renault, G., et al. High-resolution ultrasound imaging of the mouse. Journal of Radiologie. 87, 1937-1945 (2006).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M. Basic principles of ultrasonic diagnosis. GEN. 39 (4), 283-289 (1985).
- Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35, 131-137 (2007).
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
