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Artigo de método

Avaliação da Eficácia dos Perácidos Orgânicos na Erradicação de Biofilmes Laticínios Usando uma Abordagem Combinando Métodos Estáticos e Dinâmicos

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DOI:

10.3791/64619

⸱

9 de dezembro de 2022

 ,  ,  , 
1Département des Sciences des Aliments, Institut sur la Nutrition et les Aliments Fonctionnels, Université Laval

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem que combina métodos estáticos e dinâmicos para avaliar a eficácia de peroxiácidos orgânicos para erradicar biofilmes na indústria de laticínios. Esta abordagem também pode ser usada para testar a eficácia de novas formulações biológicas ou químicas para o controle de biofilmes.

Resumo

A presença de biofilmes na indústria de laticínios é de grande preocupação, pois eles podem levar à produção de produtos lácteos inseguros e alterados devido à sua alta resistência à maioria dos procedimentos de limpeza no local (CIP) frequentemente usados em plantas de processamento. Portanto, é imperativo desenvolver novas estratégias de controle de biofilme para a indústria de laticínios. Este protocolo tem como objetivo avaliar a eficácia de peroxiácidos orgânicos (ácidos peracético, perpropiônico e perlático e um desinfetante comercial à base de ácido peracético) para erradicar biofilmes lácteos usando uma combinação de métodos estáticos e dinâmicos. Todos os desinfetantes foram testados nas bactérias produtoras de biofilme mais fortes em um único ou misto biofilme usando o ensaio de concentração mínima de erradicação de biofilme (MBEC), um método estático de triagem de alto rendimento. Um tempo de contacto de 5 minutos com os desinfetantes nas concentrações recomendadas erradicou com sucesso os biofilmes simples e mistos. Estudos estão atualmente em andamento para confirmar essas observações usando o reator de biofilme do Centro de Controle de Doenças (CDC), um método dinâmico para imitar condições in situ . Este tipo de biorreator permite o uso de uma superfície de aço inoxidável, que constitui a maioria dos equipamentos e superfícies industriais. Os resultados preliminares do reator parecem confirmar a eficácia dos peroxiácidos orgânicos contra biofilmes. A abordagem combinada descrita neste estudo pode ser utilizada para desenvolver e testar novas formulações biológicas ou químicas para controle de biofilmes e erradicação de microrganismos.

Introdução

A indústria de laticínios é um importante setor industrial em todo o mundo, inclusive no Canadá, onde existem mais de 10.500 fazendas leiteiras produzindo quase 90 milhões de hL de leite a cada ano1. Apesar dos rigorosos requisitos de higiene impostos na indústria de laticínios, inclusive nas plantas de processamento, o leite constitui um ótimo meio de cultura para microrganismos e, portanto, os produtos lácteos provavelmente contêm microrganismos, incluindo deterioração ou microrganismos patogênicos. Esses patógenos podem causar várias doenças; por exemplo, Salmonella sp. e Listeria monocytogenes podem causar gastroenterite e meningite, respectivamente2. Os microrganismos de deterioração podem afetar a qualidade e as propriedades organolépticas dos produtos lácteos, produzindo gases, enzimas extracelulares ou ácidos3. A aparência e a cor do leite também podem ser alteradas, por exemplo, por Pseudomonas spp.4.

Alguns desses microrganismos podem formar biofilmes em diferentes superfícies, incluindo aço inoxidável. Tais biofilmes possibilitam a persistência e multiplicação de microrganismos na superfície do equipamento e, assim, a contaminação dos laticínios5. Os biofilmes também são problemáticos devido à sua capacidade de impedir a transferência de calor e acelerar a corrosão do equipamento, levando à substituição prematura do equipamento e, portanto, a perdas econômicas6.

Os procedimentos de limpeza no local (CIP) permitem que a indústria alimentícia controle o crescimento de microrganismos. Esses procedimentos envolvem o uso sequencial de hidróxido de sódio, ácido nítrico e, por vezes, sanitizantes contendo ácido hipocloroso e ácido peracético 7,8. Embora o ácido hipocloroso seja altamente eficaz contra microrganismos, ele também reage com a matéria orgânica natural, causando a formação de subprodutos tóxicos9. O ácido peracético não gera subprodutos nocivos10; no entanto, sua efetividade contra biofilmes na indústria alimentícia é altamente variável10,11. Recentemente, outros peroxiácidos, incluindo os ácidos perpropiônico e perlático, têm sido estudados por sua atividade antimicrobiana, e parecem ser uma boa alternativa para o controle do crescimento microbiano em biofilmes12,13.

Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia de peroxiácidos orgânicos (ácidos peracético, perpropiônico e perlático e um desinfetante à base de ácido peracético) para erradicar biofilmes lácteos usando uma abordagem que combina o ensaio de concentração mínima de erradicação de biofilme (MBEC), um método estático de triagem de alto rendimento e o reator de biofilme do Centro de Controle de Doenças (CDC), um método dinâmico que imita in situ Condições. O ensaio MBEC é doravante referido como "placas de microtitulação de biofilme" no protocolo. O protocolo aqui apresentado e os resultados representativos demonstram a eficácia dos peroxiácidos orgânicos e sua potencial aplicação para o controle de biofilmes microbianos na indústria de laticínios.

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Protocolo

O trabalho contido neste artigo requer um laboratório de nível 2 de biossegurança e foi previamente aprovado (Projeto número 119689) pelo comitê institucional de biossegurança da Université Laval.

NOTA: O fluxograma da Figura 1 representa um resumo da metodologia que combina abordagens estáticas e dinâmicas que foi utilizada para avaliar a eficácia dos peroxiácidos orgânicos na erradicação de biofilmes.

1. Preparação de materiais

  1. Isolados microbianos
    1. Ligue o armário de segurança biológica (BSC) 15 min antes do uso e limpe-o com uma solução de álcool a 70% (v/v).
    2. Uma vez que o BSC esteja estéril, coloque um frasco para injetáveis do isolado microbiano a ser testado (Pseudomonas azotoformans ou Brevundimonas vesicularis neste estudo), uma alça inoculante, um tubo de 15 mL preenchido com 10 mL de caldo de soja tríptico estéril (TSB) e um misturador de vórtice. Antes da colocação no BSC, desinfete todos os materiais com álcool.
    3. Vórtice o frasco para injetáveis de isolado microbiano para homogeneizar a cultura.
    4. Transfira assepticamente 20 μL do isolado microbiano para 10 mL de TSB estéril contido em um tubo de 15 mL e incube-o a 30 °C por 16-24 h com agitação a 160 rpm.
      ATENÇÃO: B. vesicularis deve ser utilizado num laboratório de nível de confinamento 2, de acordo com as directrizes exigidas para o manuseamento de organismos patogénicos. O manipulador deve ser devidamente treinado e deve usar óculos de segurança, luvas e um casaco.
  2. Desinfectantes
    1. Para preparar a solução de peroxiácido orgânico (60 ml), adicionar 24 ml de peróxido de hidrogénio e 36 ml de ácido (ácido acético, propiónico ou láctico) num balão de Erlenmeyer de 250 ml. Em seguida, adicione um volume predefinido de ácido sulfúrico 10 M (655 μL para o ácido peracético, 635 μL para o ácido perpropiônico ou 715 μL para o ácido perlático). Agitar suavemente o balão para misturar e colocar o balão num banho-maria a 30 °C montado no interior do exaustor químico. Incubar o balão durante 2 dias, com mistura suave todas as manhãs.
      NOTA: O desinfectante comercial à base de ácido peracético (ver Tabela de Materiais) foi fornecido directamente pelo fabricante.
      CUIDADO: Os desinfetantes devem ser usados sob um exaustor químico. Óculos de segurança e luvas devem ser usados durante a duração do experimento. Para obter mais informações sobre os desinfetantes, consulte a respectiva Ficha de Dados de Segurança do Material.
    2. Realizar titulação de peróxido de hidrogênio conforme descrito abaixo.
      1. Coloque um copo vazio de 300 mL em uma balança analítica (ver Tabela de Materiais) e pise a balança. Pesar aproximadamente 0,23 g de desinfetante no copo e observar o peso exato adicionado. Adicione 100 g de solução fria de ácido sulfúrico 1 N no copo, adicione uma barra de agitação magnética ao copo e coloque-a em uma placa de agitação.
      2. Deixe a solução mexer até à homogeneização completa. Em seguida, adicione três gotas de uma solução indicadora de ferroína (0,1% em peso em H2O) no copo e titule com solução de sulfato de cério 0,1 N até que a solução mude de uma cor rosa-salmão para uma cor azul-clara. Observe o volume de solução de sulfato de cério adicionado.
      3. Calcule a percentagem de peróxido de hidrogénio utilizando a seguinte fórmula:
        figure-protocol-1 Eq. (1)
        onde S é o volume de solução de sulfato de cério adicionado, N é a normalidade da solução de sulfato de cério (0,1 N), W é o peso da amostra (~0,2300 g) e 0,017 = (1 mol H 2 O 2/2 mol Ce) × (34,0147 g H 2 O 2 /1 mol H 2 O)2× (1 L/1.000 mL)
    3. Realizar titulação dos peroxiácidos orgânicos conforme descrito abaixo.
      1. Adicionar 20 mL de solução de iodeto de potássio a 7,5% (p/v) em um béquer. Titular lentamente com solução de tiossulfato de sódio 0,1 N até que a cor azul da solução comece a ficar castanho/laranja pálida.
      2. Adicionar 2 ml de solução de amido (1 % em peso em H2O) ao copo e titular com solução de tiossulfato de sódio 0,1 N até que a solução mude de preto para laranja. Observar o volume de solução de tiossulfato de sódio utilizado.
      3. Calcular a percentagem de peroxiácido orgânico com a seguinte fórmula:
        figure-protocol-2 Eq. (2)
        onde T é o volume de solução de tiossulfato de sódio utilizado, N é a normalidade da solução de tiossulfato de sódio (0,1 N), W é o peso da amostra (~0,2300g) e 0,038 = (1 mol CH 3 COOOH/1 mol I 2) × (1 mol I2/2 mol S2 O 3) × (76,06 g/1mol CH3 COOOH) × (1 L/1.000 mL)
        NOTA: Repita as etapas 1.2.2 e 1.2.3 com mais duas amostras para executar cada teste em triplicado.

2. Formação de biofilmes simples e mistos

  1. Placas de microtitulação de biofilme
    1. Vórtice do tubo que contém a cultura bacteriana (20 μL da estirpe + 10 ml de meio TSB, preparado no passo 1.1.4). Realizar diluição e chapeamento em série em ágar tríptico de soja (TSA) para determinar a contagem de células bacterianas (ufc) da cultura noturna. Em seguida, transfira assepticamente 100 μL da cultura para 10 mL de meio TSB estéril (para uma concentração final de aproximadamente 2 x 107 ufc/mL).
      NOTA: Para o ensaio com o biorreator, um volume de 100 μL do isolado microbiano é transferido para 100 mL de TSB estéril.
    2. Vórtice do tubo. Para cada bactéria, transfira a cultura bacteriana diluída para a placa de microtitulação de biofilme (150 μL por poço) em triplicado usando uma pipeta multicanal. Carregue 150 μL de meio TSB em três novos poços para servir como controles. Incubar a placa de microtitulação de biofilme (ver Tabela de Materiais) a 30 °C durante 24 h sem agitação.
      NOTA: Para ensaios de biofilme misto, adicionar 75 μL de cada suspensão para um volume total de 150 μL. A placa de microtitulação de biofilme contém pinos em suas tampas, nas quais os biofilmes se formam.
  2. Biorreator
    1. Limpe e seque ao ar as partes do biorreator (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante e proceda à preparação do reator conforme descrito abaixo.
      1. Primeiro, coloque a lâmina plana dentro do copo de vidro de 1 L (biorreator), que é anexado ao seu suporte por uma barra magnética, e mantenha a configuração em uma posição vertical por meio da barra de plástico presa no lado interno da tampa do biorreator.
      2. Coloque os cupons ou lâminas de aço inoxidável (consulte Tabela de Materiais) em suas hastes de polipropileno usando a chave de fenda e insira-os nos orifícios da tampa, sem colocar seus pinos de alinhamento nos entalhes, para permitir que o vapor escape durante a esterilização.
      3. Cubra todas as aberturas do biorreator com folha de alumínio e envolva o resto do equipamento, ou seja, a tubulação L/S 18 (ID = 7,9 mm) e L/S 16 (ID = 3,1 mm), a quebra de fluxo de vidro, as tampas do recipiente, as chaves de fenda, a pinça e os filtros de 0,2 μm, com folha de alumínio.
        NOTA: Insira o tubo de silício (consulte Tabela de materiais) na farpa localizada na superfície interna da tampa média do recipiente.
      4. Autoclave do biorreactor instalado em ciclo seco a 121 °C durante 20 min.
    2. Realizar a formação de biofilme no biorreator em modo de batelada (primeira etapa).
      1. Em um BSC, conecte uma extremidade da tubulação L/S 18 ao bico de saída do biorreator e mantenha a outra extremidade envolta em folha de alumínio para preservar a esterilidade.
      2. Remova um cupom ou suporte de lâmina da tampa do biorreator e coloque-o em um tubo estéril de 50 mL. Posteriormente, encher o copo do biorreator com 340 mL de meio TSB de 300 mg/L através do orifício que foi ocupado pela haste utilizando uma pipeta sorológica de 50 mL.
      3. Inocular o meio de cultura no biorreator com 1 mL da solução bacteriana (~108 ufc/mL de P. azotoformans) usando uma pipeta de 5 mL através do mesmo orifício usado anteriormente e, em seguida, colocar a haste de volta à sua posição original. Posicione as hastes que já estão colocadas nos orifícios da tampa para que os pinos se encaixem em seus respectivos entalhes.
      4. Coloque um filtro de purga de ar bacteriano de 0,2 μm no final do tubo com o menor diâmetro, que está localizado na tampa do biorreator. O outro tubo do mesmo diâmetro permanece permanentemente entupido com uma tampa de rosca de metal ou um plugue de silicone que se fecha firmemente.
      5. Colocar o biorreactor durante 24 h sobre a placa de aquecimento regulada a 30 °C e agitar a 130 rpm.
        NOTA: Para a formação de biofilme multiespécies, use um volume igual das diferentes culturas bacterianas para obter um volume total de 1 mL para o inóculo.
    3. Realizar a formação de biofilme no biorreator em modo de fluxo contínuo (segunda etapa).
      1. Colocar um garrafão contendo 18 L de água destilada estéril no BSC e adicionar 2 L de meio de cultura TSB de 1.000 mg/L para obter uma concentração final de 100 mg/L.
      2. Cubra o recipiente com sua tampa estéril, à qual dois tubos estão conectados. O primeiro é um tubo de silicone fixado na face interna da tampa e é usado para bombear o meio. O segundo tubo (L/S 16) é conectado à porta externa para permitir que o líquido flua em direção ao biorreator. Coloque um filtro de 0,2 μm no segundo tubo na tampa do recipiente médio.
      3. Conecte este segundo tubo à bomba peristáltica e junte a outra extremidade à quebra de fluxo de vidro, que é então inserida no tubo maior na tampa do biorreator.
      4. Use outro garrafão de 20 L para coletar o efluente do biorreator. Fixar a extremidade do tubo ligado à bica de saída do biorreactor à tampa do recipiente de resíduos. Insira um filtro de 0,2 μm no tubo disponível na tampa deste recipiente.
      5. Inicie a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 11,3 mL/min e deixe o sistema funcionando por 24 h.
        NOTA: A vazão (11,3 mL/min) do meio de cultura ou leite utilizado durante a formação do biofilme no biorreator foi determinada dividindo-se 340 mL (que corresponde ao volume do líquido dentro do reator) pelo tempo de residência de 30 min.
    4. Recupere o biofilme bacteriano.
      1. Desligue a bomba peristáltica e pare de agitar e aquecer o biorreator.
      2. Remova cuidadosamente cada haste do biorreator e enxágue os cupons ou lâminas 3x em 40 mL de PBS para eliminar as bactérias planctônicas. Depois, libere os cupons ou deslize em tubos cônicos estéreis de 50 mL contendo 40 mL de PBS usando uma chave de fenda apropriada. Vórtice os tubos por 30 s, transfira-os para um rack colocado em um banho de sonicator e sonicate os tubos a 40 kHz por 30 s (o que requer 110 W de potência). Repita esta operação 3x.
      3. Colete as suspensões de biofilme de 40 mL em tubos cônicos estéreis de 50 mL e, em seguida, enxágue os cupons ou lâminas com 2 mL de solução estéril de PBS. Recupere este líquido de enxágue e adicione-o à suspensão de biofilme já recolhida.
    5. Enumerar as bactérias viáveis no biofilme: Com a suspensão de biofilme obtida, realizar diluições seriadas de 10 vezes e, em seguida, chapear 100 μL das diluições de 10−5 e 10−6 na TSA em triplicado. Incubar as placas a 30 °C durante 24 h. Conte o número de colônias presentes nas placas de ágar e calcule a densidade bacteriana nos cupons e lâminas (bactérias sésseis viáveis) de acordo com a norma ASTM E2562-1714 usando a seguinte fórmula:
      figure-protocol-3 Eq. (3)
      onde X é o número de unidades formadoras de colônias (UFC), B é o volume chapeado (0,1 mL), V é o volume no qual o biofilme está suspenso (a solução-mãe), A é a superfície do cupom ou lâmina coberta pelo biofilme e D é o fator de diluição.

3. Avaliação quantitativa da eficácia dos peroxiácidos orgânicos na erradicação de biofilmes

  1. Placas de microtitulação de biofilme
    1. Adicione 200 μL de solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) em três poços de uma microplaca de 96 poços.
    2. Transfira a tampa da microplaca de biofilme, com biofilmes que se formaram nos pinos, para a microplaca de 96 poços contendo o PBS por 10 s, a fim de lavar os biofilmes e eliminar bactérias planctônicas.
    3. Prepare os desinfetantes nas concentrações necessárias (por exemplo, 25 ppm, 50 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 5.000 ppm, 10.000 ppm e 25.000 ppm de substância ativa).
      NOTA: Todas as diluições são feitas assepticamente usando água destilada estéril.
    4. Adicionar 200 μL de cada concentração de desinfetante aos poços de uma nova placa de microtitulação de 96 poços em triplicata. Transfira a tampa da placa de microtitulação de biofilme para esta placa de microtitulação de 96 poços contendo os desinfetantes e incube a placa à temperatura ambiente durante o tempo de exposição desejado.
    5. Adicione 200 μL de caldo neutralizante Dey-Engley aos poços de uma nova placa de microtitulação de 96 poços. Transfira a tampa da placa de microtitulação de biofilme na placa de microtitulação de 96 poços contendo o caldo neutralizante. Sele a placa de microtitulação com parafilme e coloque-a no sonicator de banho a 40 kHz por 30 min.
    6. Após 30 min, remova a placa de microtitulação do sonicator e remova o parafilme. Transfira 100 μL da primeira coluna da placa de 96 poços contendo os biofilmes destacados após a sonicação para a primeira fileira de uma nova placa de microtitulação de 96 poços.
    7. Adicionar 180 μL de PBS estéril 1x aos poços da nova microplaca de 96 poços (preparada na etapa 3.1.6), exceto na primeira linha. Transferir 20 μL da solução de biofilme da primeira fileira para os poços da segunda fila contendo 180 μL de 1x PBS (Linha 2, diluição: 10−1). Em seguida, transfira 20 μL do líquido contido na segunda fileira para os poços na próxima fileira contendo 180 μL de 1x PBS (Linha 3, diluição: 10−2). Repita o mesmo procedimento para obter diluições entre 10−5 e 10−7.
    8. Inocular 100 μL das diluições em TSA e incubar as placas de acordo com os parâmetros necessários para o crescimento de cada bactéria.
    9. Após a incubação, contar o cfus e calcular a densidade log 10 para cada pino e a redução log10 em cada concentração de desinfetante com as seguintes equações:
      figure-protocol-4 Média (4)
      onde X são as unidades formadoras de colônias contadas no ponto, B é o volume chapeado (0,01 mL), V é o volume do poço (0,20 mL), A é a área de superfície do pino (46,63 mm2) e D é a diluição.
      figure-protocol-5 Média (5)
    10. Repita cada experimento 3x em dias independentes.
      NOTA: A "concentração mínima de desinfetante que erradica o biofilme", ou MBEC, corresponde à menor concentração de desinfetante que não apresenta crescimento bacteriano.
  2. Biorreator
    NOTA: O procedimento da norma ASTM E2871-1915 é seguido para realizar este teste com P. azotoformans PFlA1.
    1. Comece formando os biofilmes nos cupons no biorreator, conforme descrito na etapa 2.2. Em seguida, retire a haste que contém os cupons e enxágue-a dentro de um tubo cônico contendo 30 mL de PBS.
    2. Solte cada cupom em um tubo cônico estéril de 50 mL usando uma chave de fenda e, em seguida, adicione 4 mL da solução de peroxiácido orgânico apropriado ou PBS para o controle. Incubar por 5 minutos e, em seguida, adicionar 36 mL de caldo neutralizante Dey-Engley. Vórtice por 30 s e, em seguida, sonicate a 40 kHz por 30 s usando um banho de sonicador. Repita o processo 3x para obter a suspensão de biofilme.
    3. Da mesma forma, lave todas as outras hastes e recupere os biofilmes dos cupons. Realizar diluições seriadas da suspensão de biofilme e da placa de 0,1 mL em meio TSA. Incubar as placas a 30 °C durante 24 h.
    4. Após a incubação, conte o ufc e, em seguida, calcule a densidade do biofilme para cada cupom (Eq. 6), a densidade logarítmica média (LD) para cada conjunto de três cupons da mesma haste, incluindo tratada e controle (Eq. 7), e a redução logarítmica para o desinfetante (Eq. 8) usando as seguintes equações:
      figure-protocol-6 Eq. (6)
      onde X é a média das unidades formadoras de colônias contadas/cupom, B é o volume chapeado (0,1 mL), V é o volume de desinfetante ou PBS mais neutralizador (40 mL) e D é a diluição.
      figure-protocol-7 Média (7)
      figure-protocol-8 Média (8)

4. Avaliação qualitativa da eficácia dos peroxiácidos orgânicos na erradicação de biofilmes

NOTA: Após o tratamento com os desinfetantes (etapa 3.1.1 a etapa 3.1.5), os biofilmes de P. azotoformans que se formaram nas estacas da placa de microtitulação do biofilme no método estático foram preparados e analisados por observação em microscópios eletrônicos de varredura e confocais.

  1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
    1. Adicione 200 μL de 1x PBS a três poços de uma microplaca de 96 poços. Transfira a tampa da placa de microtitulação de biofilme (etapa 3.1.5) para a microplaca de 96 poços contendo PBS e deixe-a à temperatura ambiente por 10 s para eliminar o caldo neutralizante de Dey-Engley.
    2. Remova os pinos da placa de microtitulação de biofilme usando alicates de nariz de agulha esterilizados. Coloque cada pino num frasco para injetáveis vazio sob um exaustor e adicione o fixador primário (glutaraldeído a 5% em tampão de cacodilato de Na 0,1 M pH 7,5) a cada frasco para injetáveis. Tampar cada frasco para injetáveis e incubá-los a 4 °C durante 24 h.
    3. Após a incubação, decante o fixador com uma pipeta e descarte todos os resíduos líquidos em um recipiente apropriado. Retire as tampas de cada frasco para injetáveis e coloque-as num exaustor para secar ao ar durante 72 h.
    4. Monte as amostras em tubos de alumínio (ver Tabela de Materiais) aplicando resina epóxi (ver Tabela de Materiais) na superfície superior plana de cada esboço. Em seguida, afixe cuidadosamente as estacas nos stubs com fórceps.
    5. Metalize as amostras com um esguicho de ouro EMS950x + 350s (ver Tabela de Materiais) por 4 min a 2 x 10−1 bar de pressão de argônio e corrente de 20 mA. Execute o aterramento apropriado pintando o lado do pino não exposto ao ouro com tinta prateada (consulte Tabela de materiais).
    6. Adquira imagens em um microscópio eletrônico de varredura usando a interface do usuário de controle SEM versão 6.28 (consulte Tabela de materiais). A tensão de aceleração utilizada neste estudo foi de 15 kV, e as ampliações foram de 300x e 2.000x.
  2. Microscopia confocal
    1. Adicione 200 μL de 1x PBS a três poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Transfira a tampa da microplaca de biofilme para a placa de 96 poços que contém o PBS e deixe-a por 10 s para eliminar o caldo neutralizante de Dey-Engley.
    2. Preparar soluções de manchas fluorescentes adicionando 3 μL de coloração fluorescente verde e 3 μL de coloração fluorescente vermelha (ver Tabela de Materiais) a 1 mL de água estéril.
    3. Adicionar 200 μL de solução de coloração em um poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. Transfira a tampa da placa de microtitulação de biofilme para a placa de 96 poços que contém a solução de coloração. Cubra a placa de microtitulação de biofilme com papel alumínio e incube a amostra por 20-30 min à temperatura ambiente.
    4. Adicione 200 μL de água esterilizada nos poços de uma microplaca de 96 poços. Em seguida, transfira a tampa da microplaca de biofilme para a microplaca de 96 poços que contém a água e deixe-a até a observação.
    5. Visualize os biofilmes formados nas estacas usando um microscópio de varredura a laser confocal (ver Tabela de Materiais) com uma objetiva DIC de óleo 63x/1,40. Adquira as imagens usando o software associado (consulte Tabela de materiais). Os comprimentos de onda de excitação por fluorescência utilizados para as colorações fluorescentes verde e vermelha foram de 482 nm e 490 nm, respectivamente.
      NOTA: Para obter os melhores resultados, corte e coloque o pino em uma placa de Petri de 60 mm e encha o prato com água estéril.

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Resultados

A análise do MEV mostra a presença de biofilmes produzidos por P. azotoformans PFl1A nas estacas de microplacas de biofilme (Figura 2A). Uma estrutura tridimensional de biofilme pode ser observada. O P. azotoformans PFl1A foi previamente identificado como um forte produtor de biofilme (A570 > 1,5) utilizando placas de microtitulação de 96 poços12.

Além disso, o biofilme PFl1A de P. azotoformans que s...

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Discussão

O ensaio MBEC (biofilm microplate assay) foi o primeiro método a ser reconhecido como um teste padrão de erradicação de biofilme pela ASTM17. Nosso estudo e outros mostraram que existem duas etapas críticas ao usar este ensaio: a etapa de sonicação (tempo e potência) e o tempo de tratamento desinfetante18. Stewart e Parker também sugeriram outros parâmetros que poderiam influenciar o resultado do ensaio, como a espécie microbiana, a idade do biofilme, a relação área de supe...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc e pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17). Agradecemos a Teresa Paniconi pela revisão crítica do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 µ Filtros M Corning09-754-28diâmetro: 50 mm, PTFE- Membrana
316 cupom de disco de aço inoxidávelBiosurface Technologies CorporationRD128-316
cupom deslizante de aço inoxidável 316Biosurface Technologies CorporationCBR 2128-316
placa de 96 microtitulaçãoCorning07-200-89microplaca de fundo plano tratada com cultura de células 
Ácido acéticoSigma Aldrich27225loja na RT
Pontas de alumínioMicroscopia Eletrônica Ciência75830-1032x5mm
Glutaraldeído aquoso EM Grau 25%Microscopia Eletrônica Ciências16220loja em -20 ° C
AB204-S/FACT Balança AnalíticaMettler ToledoAB204-S
Filtro de Ventilação Bacteriana (0.45 µ m)Biosurface Technologies CorporationBST 02915
BioDestroyGroupe Sani Marc09-10215desinfetante comercial à base de ácido peracético, armazenado na RT
Carboy LDPE 20 LCole Parmer06031-52
Reator de biofilme CDCBiosurface Technologies CorporationCRB 90biorreator
sulfato de cério (IV)Thermo Scientific35650-K2armazena no
RT Confocal laser scanning microscope  LSM 700ZeissLSM 700
Dey-Engley caldo neutralizanteMilliporeD3435-500Garmazenar em 4 ° C
EMS950x + 350s gold sputter Ciências da Microscopia Eletrônica Ciências da Microscopia
cola Epoxy14121com
álcool etílico de BDMA 95%, lojada P016EA95Greenfieldna
RT Solução do indicador SigmaAldrich318922-100MLloja na RT
Enchimento/venting tampãoCole ParmerRK-06258-00
Kit de Viabilidade de Biofilme FilmTracer LIVE/DEADInvitrogenL10316kit de viabilidade de células fluorescentes (SYTO 9: mancha fluorescente verde, iodeto de propídio: mancha fluorescente vermelha), armazenar a - 20 &graus; C
Quebra de fluxo de vidroBiosurface Technologies CorporationFB 50
Gold com pintura prateada Microscopia Eletrônica Sciences12684-15
Conjunto de placas de aquecimentoBiosurface Technologies Corporation110V Stir Plate
Chave de fenda hexagonalBiosurface Technologies CorporationCBR 5497
Peróxido de hidrogênioSigma216763armazenar em 4 ° C
Alças de inoculaçãoVWR12000-812estéreis, 10 µ l
Ácido lácticoLaboratoire MATLU-0200loja em RT
MASTERFLEX L / S 7557-04 W / 7557-02 com bomba peristáltica EASY-LOAD II e 77200-50 HeadCole Parmer77200-60
MBEC (Concentração Mínima de Erradicação de Biofilme) inoculador de biofilme com base de 96 poçosInnovotech19111Placa de microtitulação de biofilme
Base de ágar Oxford ThermoScientificOXCM0856Bloja em 4 ° C
Porta-cupons de plásticoBiosurface Technologies CorporationCBR 2203
Haste porta-lâminas de plásticoBiosurface Technologies CorporationCBR 2203-GL
Iodeto de potássioFisher ChemicalP410-500armazene na RT
Chave de fenda de precisão (1,5 mm x 40 mm)Wiha26015
Laboratório de ácido propiônico MATPF-0221loja na RT
Sartorius BCE822-1S Entris® II Balança de Carregamento Superior Essencial BásicoCole Parmer  UZ-11976-3
Microscópio eletrônico de varredura JSM-6360LV modeloJEOLJSM-6360LVSEM e interface de controle do usuário
Tubo com tampa de rosca, 15 mLSarstedt62.554.205(LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, base cônica, transparente, HD-PE
Tubo com tampa de rosca, 50 mLSarstedt62.547.205(LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, fundo cônico, transparente, HD-PE
Microscopia EletrônicaTrihidratada de Cacodilato de Sódio 12300loja em -20 ° C
Tiossulfato de sódioThermo ScientificAC124270010loja na RT
Banho de sonicaçãoFisher15-336-1225,7 L
Solução de amidoAnachemiaAC8615loja na RT
Ácido sulfúricoSigma Aldrich258105-500MLloja na RT
Ágar de soja trípticaBD BactoDF0369-17-6loja na RT
Caldo de soja trípticoBD BactoDF0370-17-3loja na RT
Tubing Masterflex L/S 16 25'ColeParmerMFX0642416
Tubing Masterflex L/S 18 25'ColeParmerMFX0642418
Tygon SPT-3350 tubulação de silício Saint-GobainABW18NSFIDx OD: 1/4 pol.x 7/16 pol.
VortexCole ParmerUZ-04724-00
Banho-maria VWR89202-970
Zen softwareZeiss
Eletrônica da resina de global de USP Ciências de

Referências

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