Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

Serena L. Cornelius; Megan M. Colonnetta; Katherine E. Lake; Clayton A. Smith; Yu-An Zhang; Evanthia T. Roussos-Torres; Sangeetha M. Reddy; Elizabeth H. Chen; Isaac S. Chan

doi:10.3791/64626

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Artigo de método

Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

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DOI:

10.3791/64626

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11 de novembro de 2022

Serena L. Cornelius¹^,² , Megan M. Colonnetta²^,³^,⁴^,⁵ , Katherine E. Lake¹^,² , Clayton A. Smith¹^,² , Yu-An Zhang¹^,² , Evanthia T. Roussos-Torres⁶ , Sangeetha M. Reddy¹^,² , Elizabeth H. Chen²^,³^,⁴^,⁵ , Isaac S. Chan¹^,²^,³^,⁴

¹Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of Texas Southwestern Medical Center, ²Harold C. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center, ³Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, ⁴Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, ⁵Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, ⁶Division of Medical Oncology, Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California

Neste artigo

Resumo

Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.

Resumo

Os organoides são um método confiável para modelar o tecido do órgão devido às suas propriedades auto-organizadas e retenção de função e arquitetura após a propagação do tecido primário ou células-tronco. Este método de geração de organoides renuncia à diferenciação unicelular através de múltiplas passagens e, em vez disso, usa centrifugação diferencial para isolar organoides epiteliais mamários de tecidos dissociados mecanicamente e enzimaticamente. Este protocolo fornece uma técnica simplificada para a produção rápida de organoides epiteliais pequenos e grandes a partir de tecido mamário humano e camundongo, além de técnicas para incorporação de organoides no colágeno e na matriz extracelular do porão. Além disso, instruções para fixação em gel e coloração imunofluorescente são fornecidas com a finalidade de visualizar a morfologia e a densidade organoides. Essas metodologias são adequadas para uma miríade de análises a jusante, como a co-cultura com células imunes e a modelagem de metástases ex vivo por meio de ensaio de invasão de colágeno. Essas análises servem para elucidar melhor o comportamento célula-célula e criar uma compreensão mais completa das interações dentro do microambiente tumoral.

Introdução

A capacidade de modelar células epiteliais in vitro tem sido a base da pesquisa biomédica moderna, porque captura características celulares que não são acessíveis in vivo. Por exemplo, o crescimento de linhagens celulares epiteliais em um plano bidimensional pode fornecer uma avaliação das mudanças moleculares que ocorrem em uma célula epitelial durante a proliferação¹. Além disso, a mensuração da regulação dinâmica entre sinalização e expressão gênica é limitada em sistemas in vivo ². Na pesquisa do câncer, a modelagem da linhagem celular epitelial do câncer permitiu a identificação de fatores....