Um dos principais impulsionadores dos fenótipos celulares em eucariotos é a expressão gênica. O controle da expressão gênica é essencial e depende de múltiplas proteínas e RNAs, desde a transcrição até os processos de tradução1. Alterações ao longo dessas etapas podem desencadear várias doenças diferentes. O processamento e o splicing de RNA constituem um importante grupo de reações responsáveis pela geração de moléculas de RNA maduras 2,3,4,5. O splicing remove íntrons e une éxons para gerar uma molécula de RNA madura capaz de realizar atividades funcionais e estruturais. As eficiências e taxas de splicing impactam muito os fenótipos observados em diferentes condições6.
O splicing é realizado por uma complexa maquinaria macromolecular denominada spliceossomo, que é composta por cinco snRNAs e mais de 100 proteínas 5,7. Além dos componentes proteicos centrais, os spliceossomos possuem proteínas transatuantes, o que pode afetar diretamente a regulação desse processo 8,9. A importância do splicing se reflete no amplo espectro de doenças causadas por alterações nesse processo, incluindo distúrbios neurodegenerativos, doenças neuromusculares e vários tipos de câncer 3,10,11. O estudo da dinâmica do splicing e da montagem do spliceossomo pode ter um grande impacto na compreensão da biologia desses distúrbios.
A montagem do spliceossomo começa com a associação do snRNP U1 com uma região específica do pré-mRNA recentemente transcrito, o sítio de sp. 5' 5,8. O emparelhamento eficiente e o reconhecimento de locais de splice 5 'pelo snRNA U1 não apenas definem os locais de splice que devem ser usados, mas também controlam quais pré-RNAs serão emendados primeiro, ou de forma mais eficiente 6,12,13. O uso de diferentes locais de splice pode gerar múltiplas isoformas alternativas de RNAs maduros a partir do mesmo gene. O splicing alternativo é uma importante fonte de diversidade proteômica, permitindo a geração dos RNAs e proteínas necessários durante o desenvolvimento ou em diferentes células e tecidos14,15. Transcritos alternativos de RNA podem gerar isoformas proteicas truncadas ou não funcionais, o que pode causar doenças10,16. Portanto, os componentes proteicos do complexo U1 snRNP têm um importante papel regulador no splicing1. A galectina-1 e a galectina-3 (Gal1 e Gal3) são componentes do U1 snRNP17,18. Voss et al.19 propõem um método de fracionamento de extrato nuclear para obter complexos enriquecidos com Gal3-U1 snRNP capazes de resgatar a atividade de splicing em células depletadas de U1. Esta análise contribui para a compreensão do mecanismo de associação de Gal3 aos spliceossomos, e abordagens semelhantes podem ser usadas para explorar outras proteínas reguladoras potenciais de splicing.
A ligação de U1 snRNP a locais de splice 5 'é um importante mediador da fidelidade do splicing20. Mutações nos locais de splice 5' são críticas e causam a perda do emparelhamento U1 snRNP, resultando em defeitos de splicing2. A fibrose cística, por exemplo, é causada por um local de splice 5' mutado no gene CFTR21. Wong et al.22 descrevem um método para compensar mutações no sítio de spicie 5' com mutações complementares em snRNAs U1. A abordagem promove com sucesso a inclusão de éxons, gerando RNAs maduros e resultando em resgate de defeitos de splicing. Além de oferecer uma possível terapia baseada em RNA para essas doenças, essa abordagem pode ser útil para a análise de sequências regulatórias individuais em pré-mRNAs23.
A fidelidade da associação de snRNA U1 a locais de emenda também é explorada no sistema modelo de levedura por van der Feltz24. A levedura de brotamento Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada para explorar a cinética de splicing e a montagem de spliceossomos25. A cinética de splicing e a composição do spliceossomo são bem conservadas em eucariotos, e a levedura tem sido amplamente utilizada para monitorar a formação de complexos intermediários durante a montagem26. O ensaio repórter ACT1-CUP1 é baseado na expressão de um par de genes: ACT1, que contém um íntron com sequências de locais de emenda ideais, e CUP1, que expressa um quelante de cobre, protegendo a célula dos danos causados por esse íon metálico. CUP1 só é expresso se ACT1 for emendado corretamente, criando assim o sistema de relatório27. O crescimento celular sob condições com diferentes concentrações de cobre pode ser monitorado para abordar a eficiência de splicing de diferentes sequências de íntrons ou usando diferentes proteínas reguladoras. van der Feltz24 apresenta um método para analisar os efeitos de uma proteína reguladora de splicing usando este sistema repórter e ensaios de viabilidade de cobre. Uma abordagem semelhante pode ser usada para projetar variações nas sequências de íntrons em combinação com diferentes proteínas para abordar o sucesso do splicing em leveduras.
Além da associação de snRNP, a ligação de proteínas é essencial durante a montagem do spliceossomo1. O controle da atividade do spliceossomo depende diretamente de sua composição proteica e das interações que ocorrem durante sua formação. As características estruturais e funcionais dos componentes proteicos são importantes para ativar o complexo 5,7. Carvalho et al.28 utilizam uma abordagem baseada no método Grafix, que se baseia na reticulação de proteínas não reversíveis na análise do gradiente de glicerol. Esta análise aborda a composição das proteínas e as interações transitórias que ocorrem durante a montagem, o que pode ser crítico para a montagem do complexo ativo e o sucesso do splicing. A análise de outros complexos macromoleculares dinâmicos com essa abordagem pode ser muito útil e fornecer informações sobre a organização e as interações das proteínas.
A química e a velocidade do splicing também são afetadas pela associação dinâmica dos diferentes componentes do spliceossomo8. Recentemente, o uso de inibidores de splicing de moléculas pequenas revelou que etapas específicas podem ser paralisadas in vitro devido à velocidade reduzida das reações de splicing29,30. Basei et al.31 apresentam um método para analisar o splicing alternativo sobre a influência do fator regulador do splicing, Nek4. A prevalência de isoformas de transcrição que levam a fenótipos pró ou antitumorais em células HEK293 usando um minigene é abordada. A má regulação do splicing ou diferentes usos de locais de splice pode levar à geração alternativa de transcritos, causando diferentes tipos de câncer16. O uso de moduladores ou inibidores de splicing durante a terapia pode determinar as escolhas do local de splice, definindo, portanto, as isoformas alternativas geradas, sejam pró ou antitumorais. O paclitaxel e a cisplatina são atualmente usados como agentes quimioterápicos. Com o uso do minigene E1A, os efeitos dessas drogas em splicing alternativo são abordados. A análise de splicing alternativo usando minigenes é uma estratégia importante para monitorar os efeitos de proteínas trans-atuantes e alterações de splicing sobre a terapia e o uso de drogas específicas.
Nesta linha, muitos microRNAs intrônicos (miRNAs) foram relatados como associados a fenótipos tumorais 32,33. O controle e a regulação da síntese e biogênese de miRNAs intrônicos podem estar associados ao controle de reações de splicing. Os miRNAs podem modular a estabilidade e a prevalência de mRNAs nas células, afetando a estabilidade do RNA e a taxa de tradução34 . Gatti da Silva e Coltri35 descrevem um sistema repórter para avaliar a biogênese e maturação de miRNAs intrônicos, que pode estar diretamente ligado a alterações nos fenótipos celulares e à determinação de características pró ou antitumorais. Com a modulação da proteína reguladora de splicing HuR, o sistema permite a análise da biogênese e atividade funcional de um miRNA oncogênico intrônico.
A análise do splicing de pré-RNA e a maturação de diferentes RNAs em células específicas serão essenciais para entender e interpretar informações genômicas. Leveduras e spliceossomos de mamíferos são conservados, e a pesquisa básica pode melhorar o uso dos diferentes métodos aplicados à terapêutica e à biomedicina. Apesar da grande quantidade de dados genômicos atualmente disponíveis, a expressão dessa informação nos fenótipos pode ser específica da célula e dependente do processamento e splicing do RNA. Compreender a complexa regulação desse processo será essencial para pesquisas futuras.