Method Article

Métodos e protocolos para imagens ao vivo em desenvolvimento

DOI:

10.3791/64642

⸱

January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTIGOS DISCUTIDOS:

Januschke, J., Loyer, N. Aplicações de imobilização de tecidos de Drosophila com coágulos de fibrina para imagens ao vivo. Jornal de Experimentos Visualizados. (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. Um sistema de explante para estudos de imagem de lapso de tempo da montagem do circuito olfativo em Drosophila. Jornal de Experimentos Visualizados. (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. Imagem in vivo de tecido cerebral totalmente ativo em larvas e juvenis de peixe-zebra acordados por remoção de crânio e pele. Jornal de Experimentos Visualizados. (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Imagens ao vivo simultâneas de vários embriões de insetos em microscópios de fluorescência de folha de luz baseados em câmara de amostra. Jornal de Experimentos Visualizados. (163), 10.3791/61713 (2020).

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS imagens de células vivas durante o desenvolvimento neuronal. Jornal de Experimentos Visualizados. (168), 10.3791/62165 (2021).

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Imagem sem rótulo da dinâmica de armazenamento de lipídios em Caenorhabditis elegans usando microscopia de espalhamento Raman estimulada. Jornal de Experimentos Visualizados. (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Ablações de volume profundas e espacialmente controladas usando um microscópio de dois fótons na gástrula do peixe-zebra. Jornal de Experimentos Visualizados. (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

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O desenvolvimento é caracterizado pela mudança dinâmica de estruturas nos níveis de organelas, células e órgãos. A capacidade da imagem de lapso de tempo de coletar informações quadridimensionais da mesma estrutura em sua condição fisiológica a torna uma técnica ideal para estudar o processo dinâmico de desenvolvimento 1,2,3,4,5,6. A grande quantidade de dados coletados por meio de imagens ao vivo também permite a análise quantitativa do desenvolvimento. Embora a imagem de lapso de tempo tenha sido mais amplamente utilizada para cultura de células de camada única, a imagem de tecidos vivos tridimensionais ou animais é muito mais desafiadora devido a dificuldades técnicas, como dispersão de luz de tecidos vivos, desenvolvimento de uma estratégia de montagem e método de marcação apropriados, manutenção da condição fisiológica normal durante um período de imagem extenso, acessibilidade a um microscópio adequado, etc. Esses desafios restringem o uso de imagens ao vivo em muitos laboratórios. Nesta coleta de métodos, sete artigos relataram novos métodos de preparação de amostras vivas, rotulagem e manipulação baseada em laser. Todos esses métodos facilitam a imagem ao vivo dos processos de desenvolvimento de diferentes ângulos.

A imagem direta de regiões profundas é tecnicamente desafiadora devido à forte dispersão de tecidos vivos. Esse espalhamento pode ser minimizado pela exposição de órgãos internos por meio de dissecação, melhorando assim a resolução espacial das imagens. Nesta coleção, Januschke e Loyer7 descreveram um protocolo para dissecar cérebros de larvas de Drosophila e um método de montagem usando coágulos de fibrina. Essa estratégia de montagem permitiu a aquisição de imagens com lapso de tempo usando microscópios invertidos de várias amostras no mesmo prato, pois exigia apenas a adição de fibrinogênio e trombina. Li e Luo8 apresentaram um protocolo para a dissecção de um explante antena-encefálica de pupas de moscas e uma condição de cultura ex vivo que manteve o desenvolvimento normal do circuito olfatório por 24 h. Seu sistema permitiu visualizar o direcionamento axonal e dendrítico na montagem de um circuito olfativo de mosca a partir de sua condição fisiológica. Este sistema de explante é adequado para microscópio de dois fótons e microscópio de folha de luz treliçada com imagens baseadas em óptica adaptativa, permitindo imagens contínuas de longo prazo e imagens rápidas com alta resolução espaço-temporal em um curto período de tempo. Schramm et al.9 desenvolveram um procedimento cirúrgico minimamente invasivo para remover a pele e a cartilagem mole do crânio do peixe-zebra por meio de micropeeling. Isso permitiu que eles observassem alguns eventos-chave em estágios posteriores de desenvolvimento, incluindo diferenciação neuronal, maturação, plasticidade e Ca2+ transitório até 30 dias após a fertilização. Também permitiu que eles realizassem imagens ao vivo após a pigmentação das peles das larvas do peixe-zebra. Além da dissecação, a montagem adequada de amostras também é crucial para imagens ao vivo. Ratke et al.10 apresentaram uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos embriões de moscas usando microscopia de folha de luz. Este protocolo aumentou o rendimento geral e é ideal para estudos comparativos.

Além da preparação da amostra, novos métodos de marcação facilitam a visualização de estruturas específicas em tecidos vivos. Terzi et al.11 relataram um biossensor específico de H2O2 geneticamente codificado, roGFP2-Orp1, para imagens de níveis intracelulares de H2O2 de neurônios de peixe-zebra cultivados e larvas inteiras durante o desenvolvimento. Uma vantagem importante deste biossensor H2O2 geneticamente codificado foi a melhoria da resolução temporal e espacial da detecção de H2O2 . Outro estudo de Mutlu et al.12 descreveu a microscopia de espalhamento Raman estimulado (SRS), um método de imagem química sem marcação para detecção rápida e quantitativa de lipídios em células vivas com resolução subcelular. Tanto o H2O2 quanto os lipídios são facilmente perdidos durante a fixação da amostra. O desenvolvimento de métodos de marcação ou imagem em tecido vivo não apenas contornou esse desafio, mas também reteve informações espaciais e temporais dessas estruturas em processos biológicos.

Finalmente, a luz também pode ser usada para ablação celular. Boutillon et al.13 mostraram um método para ablação de volumes profundos e espacialmente bem definidos em peixe-zebra usando um microscópio de dois fótons. Em comparação com as ablações celulares baseadas em laser ultravioleta, o laser de dois fótons melhorou a resolução axial e a penetração do tecido. Este protocolo forneceu uma estratégia de perturbação para estudar a interação célula-célula durante o desenvolvimento.

O avanço das tecnologias microscópicas nos permitiu entender muitos processos de desenvolvimento em quatro dimensões. Os protocolos desta coleção ajudarão mais cientistas a superar a barreira técnica da imagem ao vivo em diferentes sistemas biológicos. Prevemos que mais métodos que facilitem a imagem ao vivo serão desenvolvidos no futuro.

Disclosures

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O autor não tem nada a divulgar.

Acknowledgements

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Esta edição da coleção do método JoVE foi financiada pelo NIH 1K99DC01883001. Agradeço ao meu mentor de pós-doutorado Liqun Luo, meus colaboradores Eric Betzig e Tian-Ming Fu pelo forte apoio para desenvolver meu interesse em imagens de lapso de tempo durante meu projeto de pós-doutorado. Também agradeço à Escola de Ciências do Cérebro e Medicina do Cérebro da Universidade de Zhejiang por me recrutar e me apoiar para continuar o estudo de imagem com lapso de tempo em meu próprio laboratório.

References

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  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

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