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Usando C. elegans para monitorar desequilíbrios de proteostase

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DOI:

10.3791/64643

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24 de agosto de 2022

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1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

Neste artigo

Resumo

A rede de proteostase é um sistema de controle de qualidade de proteínas celulares que garante a funcionalidade do proteoma, promovendo a saúde celular e do organismo. Com a idade, sua fidelidade diminui, levando ao aumento da vulnerabilidade do proteoma ao estresse e, eventualmente, a doenças como distúrbios neurodegenerativos e câncer. Para destacar a pesquisa sobre essa rede evolutivamente conservada, o Journal of Visualized Experiments (JoVE) apresenta uma coleção de métodos de pesquisadores usando C. elegans para monitorar desequilíbrios de proteostase. Este editorial fornece uma breve visão geral dessas diferentes abordagens experimentais para entender a rede de proteostase nos níveis celular, tecidual e do organismo.

ARTIGOS DISCUTIDOS:

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Métodos padronizados para medir a indução da resposta ao choque térmico em Caenorhabditis elegans. Jornal de Experimentos Visualizados. (161), doi:10.3791/61030 (2020).

Chauve, L. et al. RT-PCR quantitativo de alto rendimento em amostras simples e a granel de C. elegans usando tecnologia nanofluídica. Jornal de Experimentos Visualizados. (159), doi:10.3791/61132 (2020).

Bar-Ziv, R. et al. Medições de respostas fisiológicas ao estresse em C. Elegans. Jornal de Experimentos Visualizados. (159), doi:10.3791/61001 (2020).

Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align e Worm_CP, dois pipelines de código aberto para endireitamento e quantificação de dados de imagem de fluorescência obtidos de Caenorhabditis elegans. Jornal de Experimentos Visualizados. (159), doi:10.3791/61136 (2020).

Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em Caenorhabditis elegans. Jornal de Experimentos Visualizados. (175), doi:10.3791/61100 (2021).

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Usando Caenorhabditis elegans para rastrear interações de acompanhantes específicas do tecido. Jornal de Experimentos Visualizados. (160), doi:10.3791/61140 (2020).

Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Ferramentas de RNAi específicas do tecido para identificar componentes para sinalização de estresse sistêmico. Jornal de Experimentos Visualizados. (159), doi:10.3791/61357 (2020).

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. Quantificação in vivo do turnover proteico em envelhecimento de C. elegans usando dendra fotoconversível2. Jornal de Experimentos Visualizados. (160), doi:10.3791/61196 (2020).

Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Caracterização de estruturas amilóides em envelhecimento C. elegans usando imagens de fluorescência ao longo da vida. Jornal de Experimentos Visualizados. (157), doi:10.3791/61004 (2020).

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Medindo a toxicidade do peptídeo RAN em C. elegans. Jornal de Experimentos Visualizados. (158), doi:10.3791/61024 (2020).

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Abordagens quantitativas para pontuação in vivo de agregado neuronal e extrusão de organelas em grandes vesículas de exofer em C. elegans. Jornal de Experimentos Visualizados. (163), doi:10.3791/61368 (2020).

Editorial

A homeostase proteica, ou proteostase, é fundamental para a saúde celular e do organismo 1,2. Processos celulares conservados cooperam para manter um proteoma adequadamente dobrado, influenciando a síntese, dobramento e depuração de proteínas 3,4. Perturbações na proteostase têm sido associadas a doenças neurodegenerativas e cânceres relacionados à idade 5,6. Com base no alto nível de conservação, organismos modelo como o nematóide Caenorhabditis elegans (C. elegans) têm sido fundamentais para a compreensão do papel da proteostase na saúde e doença humana 7,8. C. elegans possui muitas características que o tornam um modelo experimental ideal, incluindo seu curto ciclo de vida, cutícula transparente e facilidade de manipulações químicas e genéticas9. Esta coleção de métodos fornece protocolos detalhados para monitorar desequilíbrios de proteostase em nível molecular, celular e orgânico em C. elegans.

As células respondem a interrupções na proteostase ativando uma variedade de respostas ao estresse, incluindo a resposta ao choque térmico (HSR), a resposta à proteína desdobrada (UPR) e a resposta ao estresse oxidativo (OxSR) para reajustar o proteoma celular10. Para aumentar a reprodutibilidade no campo, práticas padronizadas para a indução robusta de HSR são descritas por Golden e colegas11. RT-qPCR é um método sensível amplamente utilizado para analisar a expressão gênica quantificando o mRNA, e este ensaio pode ser usado para medir os níveis de mRNA celular de vários genes induzíveis por choque térmico11. Para estender essa abordagem à análise em larga escala e alto rendimento, Chauve et al.12 descrevem uma nova adaptação para a preparação de cDNA, acoplada a uma plataforma nanofluídica de RT-qPCR que é robusta e altamente sensível. Medições precisas da expressão gênica podem ser realizadas em vermes únicos ou amostras em massa12. Os alvos recomendados do gene de resposta ao estresse, juntamente com os pares de primers para medir a regulação positiva transcricional dos genes de resposta ao estresse, estão listados nos protocolos correspondentes12,13.

Uma limitação do uso de RT-qPCR para avaliar a ativação de respostas ao estresse é que ele pode ser caro, tecnicamente difícil e requer o uso de equipamentos especializados. Portanto, cepas repórteres transcricionais específicas da via que expressam uma proteína fluorescente sob um promotor induzível por estresse (por exemplo, hsp-16.2p::gfp para monitorar HSR) são frequentemente empregadas para avaliar as respostas ao estresse celular11. Usando um fluxo de trabalho simples baseado em Fiji de código aberto chamado Worm-align, juntamente com o pipeline CellProfiler Worm_CP, Okkenhaug e colegas14 descrevem etapas para quantificar rapidamente a fluorescência de vermes individuais. Além disso, Bar-Ziv et al.13 descrevem um método de alto rendimento usando um citômetro de fluxo de partículas grandes que permite a captura da intensidade de fluorescência, tamanho e distribuição espacial (2D) para milhares de animais. Informações sobre repórteres transcricionais para avaliar a ativação das respostas ao estresse celular, juntamente com as configurações recomendadas para microscopia de fluorescência e quantificação usando um biossorter de vermessão fornecidas 13. É importante ressaltar que esses repórteres podem ser emparelhados com ensaios específicos de sobrevivência ao estresse fisiológico que monitoram a saúde de um animal após um regime de estresse específico11,13. Embora os repórteres fluorescentes tenham a vantagem de revelar diferenças específicas do tecido, eles só podem detectar indução acima de um certo limite e a estabilidade de certos fluoróforos, como GFP, impede a detecção de variações dinâmicas na expressão gênica. Além disso, a maioria dos ensaios fisiológicos é demorada e, portanto, tem escalabilidade limitada. Apesar dessas limitações, esses métodos permitem uma caracterização abrangente dos efeitos celulares e fisiológicos dos estressores internos e externos.

Perturbações proteotóxicas crônicas estão associadas ao colapso da rede de proteostase (NP), o maquinário de controle de qualidade responsável por manter um proteoma funcional 5,6. O declínio progressivo da proteostase tem sido implicado em muitas doenças relacionadas à idade. C. elegans é um ótimo sistema modelo para examinar a vulnerabilidade de tecidos específicos a falhas de proteostase. Lazaro-Pena et al.15 descrevem uma abordagem para monitorar a funcionalidade muscular ou neuronal da parede corporal à medida que o verme envelhece. Essa abordagem pode ser adaptada para análise genética de alto rendimento ou triagem de medicamentos15. O grande desafio é entender como funcionam as interações entre os vários componentes do NP in vivo. Para resolver essa deficiência, Dror e colegas16 desenvolveram um sistema para coletar informações específicas sobre as interações de chaperonas moleculares, componentes-chave da NP, em tecidos específicos durante o desenvolvimento e envelhecimento. Ao acoplar perturbações específicas do tecido do equilíbrio de dobramento com mutantes disponíveis ou cepas transgênicas que permitem o silenciamento específico do tecido de genes-alvo pelo RNAi, a rede de chaperonas em um determinado tecido pode ser examinada. Complementar essa estratégia com ensaios comportamentais simples que avaliam a funcionalidade de tecidos ou tipos de células específicos pode revelar interações biologicamente relevantes do NP in vivo15,16. É importante reconhecer que os desequilíbrios de proteostase em um tecido ou tipo de célula podem afetar o sistema de controle de qualidade de tecidos adicionais de maneira não autônoma da célula. Miles e van-Oosten-Hawle17 descrevem uma abordagem para identificar mecanismos e componentes do PN não autônomo da célula usando abordagens de RNAi específicas do tecido, juntamente com uma variedade de repórteres de estresse e sensores de proteostase17. Essa estratégia permite o exame da capacidade de NP em diferentes tecidos como resultado de mecanismos de resposta ao estresse ativados por células não autônomas.

C. elegans é comumente usado para modelar doenças neurodegenerativas relacionadas à idade causadas por mutações de expansão repetidas de poliglutamina, como a doença de Huntington18. Um sensor de proteostase muito utilizado é um fragmento de poliglutamina (polyQ) fundido a uma proteína fluorescente que forma focos in vivo, dependendo do comprimento do polyQ e da idadede 19 anos. Melhorar a reprodutibilidade entre ensaios biológicos, entre indivíduos e entre laboratórios, requer definir o que está sendo pontuado como focos. Lazaro-Pena et al.15 descrevem uma estratégia para medir com precisão a formação de focos poliQ::YFP dentro de neurônios ou músculos da parede corporal durante o envelhecimento. Para monitorar as taxas de renovação da proteína huntingtina mutante propensa à agregação com expansão de poliglutamina, Pigazzini e Kirstein20 descrevem uma técnica não invasiva que requer o uso do fluoróforo fotoconversível Dendra2. Usando microscopia confocal e uma cepa de C. elegans expressando huntingtina mutante fundida a Dendra2, é possível monitorar e quantificar a degradação dessa proteína propensa à agregação em um organismo envelhecido20. Para quantificar a fibrilação amilóide de proteínas propensas à agregação, como a huntingtina mutante, a microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM) pode ser empregada21. O FLIM permite a análise não invasiva do processo de agregação, monitorando a extinção de fluoróforos nas proximidades de estruturas amilóides, diminuindo assim o tempo de vida da fluorescência21. O tempo de vida da fluorescência se correlaciona negativamente com a agregação da proteína amilóide fundida e é independente dos níveis de expressão do fluoróforo. Essa técnica permite que um pesquisador acompanhe os efeitos do envelhecimento e do comprometimento da NP na propensão à agregação de qualquer proteína. No entanto, se a intensidade do fluoróforo for baixa, isso pode se tornar problemático, pois o FLIM requer a aquisição de um número relativamente grande de fótons. Portanto, é necessária uma potência de laser de excitação mais alta, levando a um fotobranqueamento mais rápido e a uma curva de decaimento não confiável. Além disso, a técnica requer equipamentos sofisticados e caros como um complemento aos sistemas de microscopia pré-existentes. Uma importante abordagem padronizada está incluída para um protocolo diferente que investiga a tradução não dependente de AUG (RAN) associada à repetição associada ao RNA que contém expansões repetidas. Como a tradução RAN não requer um códon de início para determinar o quadro de leitura, o número de possíveis peptídeos tóxicos associados à doença aumenta. Rudich e colegas22 fornecem detalhes sobre como quantificar a toxicidade do peptídeo RAN usando o movimento e a reprodução de C. elegans.

Desequilíbrios na proteostase levam ao desdobramento de proteínas e ao acúmulo de agregados de proteínas que têm sido associados a múltiplas doenças neurodegenerativas relacionadas à idade 5,6. As cepas de C. elegans que expressam várias proteínas propensas à agregação fundidas a repórteres fluorescentes têm sido utilizadas para monitorar desequilíbrios de proteostase em diferentes tipos de células e tecidos. A análise desses modelos levou a um conjunto de novas observações; Monica Driscoll e colegas notaram que os neurônios liberam agregados PolyQ e outros detritos celulares, como organelas danificadas, em "exophers", descobrindo um ramo anteriormente não reconhecido da proteostase neuronal23. Como este é um fenômeno novo, é crucial fornecer instruções claras para monitorar a produção de exoferes para garantir a reprodutibilidade dentro do campo. Arnold et al.24 descrevem as características físicas dos exophers de C. elegans, estratégias para sua detecção, critérios de identificação e tempo ideal para quantificação. Além disso, este protocolo destaca a atenção crítica necessária para controlar rigorosamente as condições de crescimento para eliminar tensões não intencionais que podem modular os níveis de exofer para obter uma avaliação reprodutível da produção de exofer.

Esta coleção fornece várias estratégias metodológicas para monitorar desequilíbrios de proteostase em nível molecular, celular e orgânico em C. elegans. Estressores, como proteínas de doenças mal dobradas, podem ser introduzidos experimentalmente em tipos específicos de tecidos, enquanto a resposta celular e do organismo à proteotoxicidade é monitorada ao longo do tempo. Esta coleção fornece um kit de ferramentas para sondar e monitorar a proteostase, avaliar os sistemas de controle de qualidade que mantêm um proteoma dobrado e investigar a desregulação desses sistemas que levam à doença.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos aos nossos colegas por suas contribuições altamente valiosas para esta coleção de métodos.

Referências

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  20. Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In vivo quantification of protein turnover in aging C. elegans using photoconvertible dendra2. Journal of Visualized Experiments. (160), e61196(2020).
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  22. Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
  23. Melentijevic, I., et al. C. elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367-371 (2017).
  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

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