Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a imagem da dinâmica da parede celular 3D do tecido de musgo vivo, permitindo a visualização do descolamento das paredes celulares em mutantes ggb e do espessamento dos padrões da parede celular no tipo selvagem durante o desenvolvimento durante um longo período.
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Artigo de método
Imagem de lapso de tempo 3D da dinâmica da parede celular usando Calcofluor no musgo Physcomitrium patens
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de lapso de tempo com microscopia de fluorescência permite a observação das mudanças dinâmicas de crescimento e desenvolvimento nos níveis celular e subcelular. Em geral, para observações durante um longo período, a técnica requer a transformação de uma proteína fluorescente; no entanto, para a maioria dos sistemas, a transformação genética é demorada ou tecnicamente indisponível. Este manuscrito apresenta um protocolo para imagem de time-lapse 3-D da dinâmica da parede celular durante um período de 3 dias usando corante calcofluor (que cora celulose na parede celular da planta), desenvolvido no musgo Physcomitrium patens. O sinal de corante calcofluor da parede celular é estável e pode durar 1 semana sem decaimento óbvio. Usando este método, foi demonstrado que o descolamento de células em mutantes ggb (nos quais a subunidade beta da proteína geranilgeraniltransferase-I é nocauteada) é causado por expansão celular desregulada e defeitos de integridade da parede celular. Além disso, os padrões de coloração de calcofluor mudam ao longo do tempo; regiões coradas menos intensamente correlacionam-se com os futuros locais de expansão/ramificação celular no tipo selvagem. Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas que contêm paredes celulares e que podem ser corados por calcofluor.
Introdução
As paredes celulares das plantas sofrem alterações dinâmicas durante a expansão e o desenvolvimento celular 1,2,3. Manter a integridade da parede celular é fundamental para a adesão das células vegetais durante o crescimento e desenvolvimento, bem como para a resposta aos sinais ambientais. Embora a visualização da dinâmica da parede celular de células vivas durante um longo período de tempo seja fundamental para entender como a adesão celular é mantida durante o desenvolvimento e a adaptação às mudanças ambientais, os métodos atuais para observar diretamente a dinâmica da pa....
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Protocolo
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a lista de materiais e equipamentos e a Tabela 1 para a lista de soluções a serem usadas neste protocolo.
1. Preparação de plantas para pratos de fundo de vidro
- Cultivar o tecido protonemal de musgo em meio de ágar BCDAT em uma placa de Petri de 13 cm sob luz branca constante (~50 μmol m-2 s-1) por 7 dias a 25 °C na câmara de crescimento.
- Filtrar-esterilizar o calcofluor branco e conservar a 4 °C até à sua utilização. O reagente é estável por vários meses.
- Disperse o tecido de musgo de 7 dias de id....
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Resultados
Esse método permite a observação da dinâmica da parede celular durante o desenvolvimento em mutantes do tipo selvagem e ggb (Figura 1). Os resultados mostraram que regiões com menor espessamento da parede celular se correlacionam com os locais de expansão/ramificação celular, permitindo a predição de locais de expansão/ramificação no tipo silvestre (Figura 1A). A superfície das paredes celulares em mutantes ggb foi rasgada durante o desenvolvim.......
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Discussão
A reconstrução 3D de lapso de tempo, ou imagem 4D, é uma ferramenta poderosa para observar a dinâmica da morfologia celular durante os processos de desenvolvimento. Neste protocolo, misturando o branco calcofluor no meio, a dinâmica da morfologia celular 3D pode ser observada no musgo P. patens. Utilizando esse método, observamos que a superfície das paredes celulares em mutantes ggb é rasgada durante o desenvolvimento3. Além disso, o espessamento reduzido das paredes celulares e.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes ou financeiros.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Dra. Soucy Patricia e Betty Nunn, da Universidade de Louisville, pela assistência com o microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (1456884 a M.P.R.) e por um Acordo de Cooperação da National Science Foundation (1849213 a M.P.R.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtro de luz de plástico vermelho de 3 mm de espessura | Mitsubishi | No.102 | |
| Prato de base de vidro de 27 mm de diâmetro | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor branco | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor Branco M2R, 1 g/L e azul Evans, 0.5 g/L |
| Microscópio confocal | Nikon | A1 | NIS element software; arquivo .nd2 no NIS-elements Viewer, baixe em https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Microscópio de fluorescência | Nikon | TE200 | Equipado com uma câmera DS-U3; |
| Goma gelana | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| SANYO | Seringa esterilizada Sanyo MLR-350H | ||
| 0.22 μ Filtro | Millipore | SLGV033RS |
Referências
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant d....
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Reimpressões e permissões
