Artigo de método

Imagem de lapso de tempo 3D da dinâmica da parede celular usando Calcofluor no musgo Physcomitrium patens

DOI:

10.3791/64651

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10 de fevereiro de 2023

 , 
1Department of Biology, University of Louisville

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a imagem da dinâmica da parede celular 3D do tecido de musgo vivo, permitindo a visualização do descolamento das paredes celulares em mutantes ggb e do espessamento dos padrões da parede celular no tipo selvagem durante o desenvolvimento durante um longo período.

Resumo

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A imagem de lapso de tempo com microscopia de fluorescência permite a observação das mudanças dinâmicas de crescimento e desenvolvimento nos níveis celular e subcelular. Em geral, para observações durante um longo período, a técnica requer a transformação de uma proteína fluorescente; no entanto, para a maioria dos sistemas, a transformação genética é demorada ou tecnicamente indisponível. Este manuscrito apresenta um protocolo para imagem de time-lapse 3-D da dinâmica da parede celular durante um período de 3 dias usando corante calcofluor (que cora celulose na parede celular da planta), desenvolvido no musgo Physcomitrium patens. O sinal de corante calcofluor da parede celular é estável e pode durar 1 semana sem decaimento óbvio. Usando este método, foi demonstrado que o descolamento de células em mutantes ggb (nos quais a subunidade beta da proteína geranilgeraniltransferase-I é nocauteada) é causado por expansão celular desregulada e defeitos de integridade da parede celular. Além disso, os padrões de coloração de calcofluor mudam ao longo do tempo; regiões coradas menos intensamente correlacionam-se com os futuros locais de expansão/ramificação celular no tipo selvagem. Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas que contêm paredes celulares e que podem ser corados por calcofluor.

Introdução

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As paredes celulares das plantas sofrem alterações dinâmicas durante a expansão e o desenvolvimento celular 1,2,3. Manter a integridade da parede celular é fundamental para a adesão das células vegetais durante o crescimento e desenvolvimento, bem como para a resposta aos sinais ambientais. Embora a visualização da dinâmica da parede celular de células vivas durante um longo período de tempo seja fundamental para entender como a adesão celular é mantida durante o desenvolvimento e a adaptação às mudanças ambientais, os métodos atuais para observar diretamente a dinâmica da pa....

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Protocolo

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NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a lista de materiais e equipamentos e a Tabela 1 para a lista de soluções a serem usadas neste protocolo.

1. Preparação de plantas para pratos de fundo de vidro

  1. Cultivar o tecido protonemal de musgo em meio de ágar BCDAT em uma placa de Petri de 13 cm sob luz branca constante (~50 μmol m-2 s-1) por 7 dias a 25 °C na câmara de crescimento.
  2. Filtrar-esterilizar o calcofluor branco e conservar a 4 °C até à sua utilização. O reagente é estável por vários meses.
  3. Disperse o tecido de musgo de 7 dias de id....

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Resultados

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Esse método permite a observação da dinâmica da parede celular durante o desenvolvimento em mutantes do tipo selvagem e ggb (Figura 1). Os resultados mostraram que regiões com menor espessamento da parede celular se correlacionam com os locais de expansão/ramificação celular, permitindo a predição de locais de expansão/ramificação no tipo silvestre (Figura 1A). A superfície das paredes celulares em mutantes ggb foi rasgada durante o desenvolvim.......

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Discussão

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A reconstrução 3D de lapso de tempo, ou imagem 4D, é uma ferramenta poderosa para observar a dinâmica da morfologia celular durante os processos de desenvolvimento. Neste protocolo, misturando o branco calcofluor no meio, a dinâmica da morfologia celular 3D pode ser observada no musgo P. patens. Utilizando esse método, observamos que a superfície das paredes celulares em mutantes ggb é rasgada durante o desenvolvimento3. Além disso, o espessamento reduzido das paredes celulares e.......

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses concorrentes ou financeiros.

Agradecimentos

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Os autores agradecem à Dra. Soucy Patricia e Betty Nunn, da Universidade de Louisville, pela assistência com o microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (1456884 a M.P.R.) e por um Acordo de Cooperação da National Science Foundation (1849213 a M.P.R.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro de luz de plástico vermelho de 3 mm de espessura  Mitsubishi No.102
Prato de base de vidro de 27 mm de diâmetro Iwaki3930-035
Agar  SigmaA6924
Calcofluor branco   Sigma18909-100ML-FCalcofluor Branco M2R, 1 g/L e azul Evans, 0.5 g/L
Microscópio confocal Nikon A1

NIS element software; arquivo .nd2 no NIS-elements Viewer, baixe em https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

Microscópio de fluorescência Nikon TE200 Equipado com uma câmera DS-U3;
Goma gelanaNacali Tesque12389-96
SANYO Seringa esterilizada Sanyo MLR-350H
0.22 μ FiltroMilliporeSLGV033RS
Câmaras de Crescimento de Plantas

Referências

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  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant d....

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Etiquetas

Calcofluor StainingFluorescence Microscopy3D ImagingCell ExpansionCell Wall IntegrityPlant Cell WallProtonemata Separation

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