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Artigo de método

Monitorização e Modulação da Pressão Arterial em Tempo Real em Modelo de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico em Coelhos

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DOI:

10.3791/64672

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10 de fevereiro de 2023

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1Department of Radiology and Imaging Sciences, University of Utah, 2Department of Neurosurgery, University of Utah, 3Department of Emergency Medicine, University of Utah, 4Department of Radiology, Shengjing Hospital of China Medical University

Neste artigo

Resumo

O registro contínuo da pressão arterial permite a investigação do impacto de vários parâmetros hemodinâmicos. Este relato demonstra a aplicação da monitorização contínua da pressão arterial em um modelo animal de grande porte de acidente vascular cerebral isquêmico para determinação da fisiopatologia do AVC, impacto de diferentes fatores hemodinâmicos e avaliação de novas abordagens de tratamento.

Resumo

O controle da pressão arterial, tanto em termos de valores absolutos quanto de sua variabilidade, afeta os desfechos em pacientes com AVC isquêmico. No entanto, permanece desafiador identificar os mecanismos que levam a maus resultados ou avaliar medidas pelas quais esses efeitos podem ser mitigados devido às limitações proibitivas inerentes aos dados humanos. Nesses casos, modelos animais podem ser utilizados para realizar avaliações rigorosas e reprodutíveis de doenças. Aqui relatamos o refinamento de um modelo previamente descrito de acidente vascular cerebral isquêmico em coelhos que é aumentado com registro contínuo da pressão arterial para avaliar os impactos da modulação sobre a pressão arterial. Sob anestesia geral, as artérias femorais são expostas através de cortes cirúrgicos para colocação das bainhas arteriais bilateralmente. Sob visualização fluoroscópica e orientação de roteiro, um microcateter é avançado em uma artéria da circulação posterior do cérebro. Uma angiografia é realizada injetando-se a artéria vertebral contralateral para confirmar a oclusão da artéria alvo. Com o cateter oclusivo permanecendo na posição por um tempo fixo, a pressão arterial é registrada continuamente para permitir a titulação rigorosa das manipulações da pressão arterial, seja por meios mecânicos ou farmacológicos. Ao término do intervalo de oclusão, o microcateter é retirado e o animal é mantido sob anestesia geral por um tempo prescrito de reperfusão. Para estudos agudos, o animal é então eutanasiado e decapitado. O cérebro é colhido e processado para medir o volume do infarto sob microscopia de luz e posteriormente avaliado com várias colorações histopatológicas ou análise transcriptômica espacial. Esse protocolo fornece um modelo reprodutível que pode ser utilizado para estudos pré-clínicos mais aprofundados sobre os efeitos dos parâmetros pressóricos durante o AVC isquêmico. Também facilita a avaliação pré-clínica eficaz de novas intervenções neuroprotetoras que podem melhorar o atendimento a pacientes com AVC isquêmico.

Introdução

O acidente vascular cerebral isquêmico (AVC) é uma das principais causas de morte e incapacidade em longo prazo em todo o mundo, e sua prevalência deve aumentar à medida que a sociedade envelhece1. Embora avanços substanciais tenham sido feitos em intervenções agudas e estratégias de prevenção secundária, os tratamentos neuroprotetores adjuvantes não seguiram ritmo acelerado 2,3,4,5,6,7. Mais pesquisas são necessárias sobre a patobiologia do AVC porque os mecanismos pelos quais as terapias podem ou não se mostrar eficazes são pouco compreendidos. Isso se deve, em grande parte, à natureza heterogênea da população de pacientes com AVC, muitos dos quais apresentam inúmeras comorbidades que confundem a análise1. Um fator de limitações na pesquisa é a ausência de dados em nível de tecido - o padrão-ouro na pesquisa biomédica - devido à morbidade proibitiva da amostragem de tecido do sistema nervoso central humano. Especificamente, a coleta de tecido vascular em um ser humano vivo causaria um acidente vascular cerebral, de modo que o tecido vascular normalmente só é obtido na autópsia, o que é sub-representativo da população geral e inclina-se para doença mais avançada em pacientes idosos com diagnósticos concomitantes.

Nesses casos, quando dados humanos suficientes não podem ser utilizados, modelos animais podem preencher as lacunas de dados. Modelos animais de grande porte de acidente vascular cerebral são limitados, pois a maioria dos animais de grande porte utilizados em pesquisa são ungulados com rete mirabile que impede o acesso endovascular direto às artérias cerebrais8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Os coelhos têm uma longa história de uso para a investigação de doenças cardiovasculares, incluindo patologias intracranianas8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Os coelhos apresentam um modelo ideal para doenças cerebrovasculares por serem grandes o suficiente para cateterismo endovascular e não possuírem a rete mirabile que impede o acesso intracraniano em outros mamíferos de grande porte9,15,16,17. Têm sido utilizados anteriormente especificamente para a investigação de EI através da oclusão precisa e bem controlada de uma artéria intracraniana com um microcateter18.

O controle da pressão arterial (PA), tanto pela modulação da PA absoluta quanto pela variabilidade da PA (VPA), grau em que a PA arterial flutua em torno de uma PA média, é um potencial alvo terapêutico emergente para pacientes com EI, após relatos de piores desfechos naqueles com PA ou VPA malcontroladas 19,20,21,22 . Faltam investigações mecanicistas sobre como as alterações levam a maus resultados em pacientes com EI. Isso se deve, em parte, à dificuldade em obter dados em nível de tecido e realizar análises bem controladas em humanos. Para testar intervenções que modulam a PA ou a VPA, modelos animais devem ser utilizados para superar essas limitações. Este relato descreve o pareamento bem-sucedido de um modelo de EI em coelhos previamente validado usando oclusão controlada da artéria cerebral posterior em conjunto com a medida intra-arterial contínua da PA18. O método aqui apresentado melhora as abordagens anteriores da fisiopatologia do AVC ao aplicar um modelo validado e reprodutível de AVC a um sistema no qual a medida e o controle precisos da PA podem ser alcançados. Nesse modelo refinado, a carga de infarto pode ser avaliada com a coloração histopatológica pós-procedimento do cérebro colhido, que também é passível de várias colorações e análises mais avançadas, como a transcriptômica espacial. Além disso, a artéria da circulação posterior ocluída também pode ser escolhida para ser avaliada para análise de morbidade após procedimentos de sobrevida.

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Protocolo

Este protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Protocolo IACUC da Universidade de Utah Número 21-09021). Coelhos brancos maduros da Nova Zelândia são obtidos de vendedores comerciais.

1. Aquisição de animais

  1. Aclimatar os animais pelo tempo necessário após a chegada de acordo com o protocolo institucional, abrigando os animais socialmente em um biotério com dietas padrão de ração. O período de aclimatação em nossa instituição é de 2 semanas.

2. Anestesia e monitorização

  1. Induzir anestesia endotraqueal geral com injeção intramuscular de buprenorfina (0,03 mg/kg) seguida cerca de 30 minutos depois com uma injeção intramuscular de quetamina (25-35 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg). Manter a anestesia com isoflurano a 1%-5% em oxigênio administrado através de um tubo endotraqueal. Durante a indução, use 100% FiO 2 e, em seguida, titular até o FiO 2 mais baixo que mantém 100% SpO2.
    OBS: A anestesia ininterrupta é necessária para impedir a movimentação do animal para que o AVC seja a única interrupção do processo de indução do AVC. Isso também evita picos na PA que resultariam de agitação que poderia surgir de anestesia inadequada. A oxigenação consistente também é importante para controlar a obtenção de AVCs comparáveis. Todas essas medidas são contabilizadas nos resultados representativos descritos a seguir.
  2. Confirme a profundidade adequada da anestesia aplicando estímulos nocivos no dedo do pé. Aplique pomada ocular veterinária nos olhos para evitar o ressecamento.
  3. Monitorar a saturação de oxigênio por um oxímetro de pulso colocado na orelha. Obter acesso intravenoso com um cateter angio em uma veia auricular. Certifique-se de que está fixado com uma sutura ou um curativo de película transparente adesiva. Para atenuar o vasoespasmo, coloque 0,25 polegada de nitroglicerina transdérmica no interior da orelha após a indução da anestesia.
  4. Fornecer fluidos de manutenção com soro fisiológico normal a uma taxa de 1 cc/kg/h. Coloque uma sonda de temperatura esofágica para monitorar a temperatura corporal. Manter a normotermia (33-37 °C) conforme necessário com mantas de aquecimento colocadas sob o animal.

3. Preparo cirúrgico

  1. Coloque o coelho em decúbito dorsal sobre uma mesa operatória compatível com fluoroscopia. Estenda a cabeça à medida que otimiza o posicionamento para visualizações angiográficas subsequentes. Os coelhos têm artérias extremamente sensíveis, propensas a vasoespasmo após a instrumentação.
  2. Remova os pelos de ambas as regiões inguinais usando cortadores elétricos. Em seguida, palpar os pulsos arteriais femorais bilaterais para confirmar a depuração adequada por meio de corte bilateral. Prepare a pele com esfoliantes de clorexidina e álcool e, em seguida, borrife a pele da maneira estéril habitual.
  3. Administrar anestesia local injetando-se por via subcutânea 2 mL de lidocaína a 1% nas regiões inguinais bilaterais. Realizar incisão cirúrgica de 5 cm com lâmina número 10 no local onde a lidocaína foi injetada. Utilizar dissecção romba para exposição do feixe vasculonervoso (Figura 1A). Se necessário, estender a incisão para expor adequadamente um segmento arterial grande o suficiente para acesso.
  4. Após o isolamento do feixe vasculonervoso, gotejar várias gotas de lidocaína a 1% na artéria para evitar vasoespasmo. Separe suavemente a artéria da veia e do nervo adjacente usando pinças. Identificar a artéria pela aparência característica de sua parede muscular em comparação com as paredes finas da veia. A artéria terá sangue mais brilhante, enquanto a veia conterá sangue mais escuro.

4. Acesso arterial

  1. Após o isolamento da artéria, passar a pinça de ângulo reto sob o vaso. Segure duas alças de vaso com o instrumento e passe-as suavemente sob a artéria. Situar um cada um nas extremidades a montante e a jusante da embarcação exposta.
  2. Sujeitar a artéria a uma tração suave puxando as alças do vaso. Nesse momento, inspecione o vaso em busca de qualquer tecido residual e remova-o com dissecção suave (Figura 1B). Isso aumenta as chances de sucesso no acesso.
  3. Utilizar um cateter angiocateter 22G para acesso. Leve adiante o próprio cateter sobre a agulha interna, pois esta muitas vezes gruda quando completamente assentada e pode desalojar o dispositivo durante as tentativas de acesso.
  4. Após dissecar o vaso e preparar o cateter angio, gotejar lidocaína no vaso novamente. A artéria irá dilatar visivelmente, o que aumenta as chances de sucesso do acesso e colocação de uma bainha usando a técnica de Seldinger.
  5. Aplique tração suave na alça do vaso a jusante para ingurgitar a artéria, reduzindo o fluxo de saída. Isso também estabiliza a embarcação para a tentativa de acesso. Avançar lentamente a agulha do cateter angiodinâmico para o meio do segmento arterial exposto (Figura 1C). Quando um flash de sangue é visto no angiocateter e na câmara em seu hub, avance o cateter sobre a agulha para o lúmen arterial.
  6. Se a tentativa de acesso não for bem-sucedida, obtém-se hemostasia aplicando tração na alça do vaso a montante. Lave o cateter angio com soro fisiológico e substitua-o em sua agulha introdutora para tentativas adicionais.
  7. Quando o cateter angiocateter for colocado com sucesso no vaso até seu hub, avance um microfio de Cope através da luz do angiocateter e para a aorta (Figura 1D). Remova o cateter angiodinâmico sobre o fio e substitua-o por uma bainha hidrofílica fina de 5 French (Figura 1E).
  8. Confirme o retorno do sangue arterial através da tubulação do braço lateral abrindo a válvula de três vias. Lave a bainha com soro fisiológico 0,9% e bloqueie a válvula fechada durante a lavagem.
  9. Fixe o cubo da bainha na pele adjacente com uma sutura de seda 3-0 adicional. Repetir esse processo para a artéria femoral contralateral. Para alcançar eficiências mais altas, dois operadores podem trabalhar simultaneamente enquanto se concentram em uma artéria cada.

5. Angiografia cervicocerebral e acesso intracraniano

  1. Sob visualização fluoroscópica, avançar um cateter deslizante de 4 French sobre um glidewire de 0,035 polegada inserido através da bainha femoral esquerda. Posicionar a ponta do cateter deslizante na artéria vertebral esquerda proximal. Retire o fio e lave o cateter com soro fisiológico heparinizado a 0,9%.
  2. Realizar angiografia injetando-se manualmente a artéria vertebral esquerda com contraste iodado sob baixa magnificação para visualização de toda a cabeça e pescoço (Figura 2A). Modular a injeção da solução de contraste começando com uma injeção de baixa pressão que crescendos para visualizar toda a vasculatura.
    NOTA: É necessária injeção suficiente para visualizar o refluxo pela artéria vertebral direita, pois esta imagem angiográfica será usada para orientação de roteiro para selecionar a artéria vertebral direita de forma eficiente. A injeção suave é necessária para minimizar o vasoespasmo ou lesões mais profundas. Além disso, força ou volume excessivos podem induzir movimentos transitórios do animal mesmo sob anestesia profunda.
  3. Para a injeção vertebral esquerda, injetar 50% de contraste diluído em soro fisiológico normal com um crescendo suave de uma seringa de 3 cc. A injeção de 1-2 cc do contraste diluído é tipicamente suficiente. Determinar a quantidade adequada de injeção verificando o refluxo pela artéria vertebral direita e para a artéria subclávia direita. Durante essa injeção, observe também as artérias cerebrais posteriores e cerebelares superiores, sendo uma delas o alvo a ocluir com o microcateter.
  4. Prepare um microcateter 2.4 French direcionado a fluxo com um microfio de 0,010 polegadas. Faça um formato de c na ponta do microfio. Sob orientação de roteiro, avance o microcateter dentro de um cateter deslizante de 4 French através da bainha femoral direita e sobre o fio para a artéria vertebral direita. Devido à propensão ao vasoespasmo induzido pelo cateter, minimizar o tempo de manipulação do dispositivo e o número de tentativas realizadas.
  5. Avançar o microcateter através do segmento cervical da artéria vertebral direita. Para melhor passar a curva acentuada do segmento V2 para V3, avance o microcateter sozinho enquanto o microfio está de volta proximal à sua ponta. Liderar com o microfio neste ponto muitas vezes causará seleção de pequenos ramos laterais da artéria vertebral e pode ser a fonte de vasoespasmo substancial.
  6. Após passar o giro brusco de V2 para V3, o microcateter muitas vezes passa facilmente para a artéria basilar proximal. Nesse ponto, avançar o microfio e selecionar as artérias cerebrais posteriores ou cerebelares superiores desejadas. Injeções de microcateter não são recomendadas, dada a natureza frágil das artérias intracranianas.
  7. Avançar o microcateter sobre o microfio para a artéria alvo. Escolha uma posição proximal, pois é tipicamente mais segura na parte posterior para se comunicar devido à sua angulação em sua origem. Uma posição mais profunda é factível na artéria cerebelar superior (Figura 2B).
  8. Repetir a angiografia injetando o cateter da artéria vertebral esquerda com grande magnificação sobre a cabeça para confirmar a oclusão da artéria alvo (Figura 2B-C). Para obter uma imagem ideal, injete contraste de força total na seringa de 3 cc. Normalmente, não mais do que 1 cc será necessário para a opacificação adequada de todas as artérias intracranianas.
  9. Remova suavemente o microfio do microcateter sob visualização fluoroscópica para confirmar uma posição estável. Coloque uma torneira no cubo do microcateter e feche a torneira para evitar a perda de sangue por fluxo sanguíneo retrógrado. Retirar o cateter vertebral esquerdo para disponibilizar a bainha de acesso femoral esquerdo.
  10. Durante o período de oclusão subsequente, adquirir imagens fluoroscópicas intermitentes para confirmar uma posição estável do microcateter oclusivo. Resultados de períodos de oclusão da artéria cerebral posterior variando de 60-240 min foram publicados anteriormente18.

6. Medida e modulação da pressão arterial

  1. Enquanto um sítio de acesso femoral é utilizado para o microcateter intracraniano oclusivo, utilize o introdutor contralateral para medida da PA.
  2. Registrar as leituras contínuas da PA arterial com um sensor piezoresistivo de calibre 3 French, colocado através de uma bainha femoral e avançado até que a ponta do sensor esteja na aorta torácica inferior. Conecte este sensor ao hardware de aquisição de dados e visualize as pressões medidas com seu software associado. Observe a PA na janela de visualização da pressão. Os registros de BP podem ser exportados para uma planilha eletrônica para visualização no software de estatística.
  3. Alternativamente, se a manipulação mecânica da PA for desejada usando um cateter-balão, avançar um cateter de Fogarty de 4 French 5 mm através da bainha femoral disponível. Posicionar o balão na aorta infrarrenal. Use o lúmen interno de 0,025 polegadas para traçado de pressão para monitorar continuamente a PA a montante do balão e o diâmetro de 4 French do balão para que uma segunda linha de traçado de PA seja conectada à bainha para monitoramento contínuo da PA a jusante do balão.

7. Eutanásia e colheita de tecidos

  1. Remova o microcateter oclusivo após 3 h e, em seguida, continue a medida e modulação da PA arterial pelo período adicional desejado. Um período de recuperação padrão de 3 h é usado para visualização de um infarto completo na histologia subsequente.
  2. Após completar os tempos de oclusão e recuperação prescritos, certificar-se de que o animal esteja em plano cirúrgico de anestesia e realizar a eutanásia (fixação perfusional com solução tamponada com fosfato, seguida de decapitação após confirmação de ausência de atividade cardíaca). Alternativamente, realizar a fixação da perfusão através da infusão de perfusato através de uma bainha femoral e, em seguida, transeccionar uma veia jugular, a veia cava inferior ou o átrio direito.
    NOTA: A perfusão pode ser preferível para algumas análises post-mortem, uma vez que a expressão gênica ou os valores de biomarcadores podem ser afetados pela solução. Ambas as técnicas foram realizadas com sucesso pelo nosso grupo.
  3. Em procedimentos agudos com retirada imediata do cérebro, confirme a eutanásia e decapite o animal. Remova o calvário de forma fragmentada com rongeurs, começando na crista occipital e trabalhando anteriormente até que o cérebro possa ser colhido intacto. Coloque o cérebro em formalina ou solução de temperatura de corte ideal e congele rapidamente, dependendo do tipo de análise de tecido desejada.

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Resultados

Nos experimentos iniciais com esse modelo, nosso grupo alcançou com sucesso o resultado desejado de oclusão da artéria cerebelar posterior ou superior em 12 dos 14 animais (85,7%). Para o experimento, foram estudados sete machos e sete fêmeas. O peso médio dos animais foi de 3,6 kg (± 0,46 kg). Nos dois animais em que o sucesso não foi alcançado, o vasoespasmo profundo induzido pelo cateter impediu o acesso seguro à circulação intracraniana. Em um coelho, o acesso intracraniano não pôde ser obtido devido ao vasoespasmo o...

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Discussão

Progressos substanciais têm sido feitos no manejo da SI, particularmente considerando os avanços nas estratégias de intervenção aguda e prevenção secundária. No entanto, mais trabalho pode ser feito para melhorar o atendimento aos pacientes com EI. O progresso limitado em outros aspectos do tratamento da SI, particularmente no âmbito da neuroproteção, provavelmente resulta das limitações na compreensão fisiopatológica dos processos mecanicistas em nível tecidual e molecular. Dados impactantes de humanos são irrealistas e...

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Divulgações

MDA, GH e MAJ são consultores da Certus Critical Care, Inc.

Agradecimentos

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo National Center for Advancing Translational Sciences dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de prêmio UL1TR002538 e KL2TR002539 e pelo Transformational Grant 19TPA34910194 da American Heart Association.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-0 Sutura de SedaEthiconA184H
BuprenorfinaSigma-AldrichB9275
CateterTerumoCG4154F Cateter deslizante
Sensor de Pressão EndovascularMillarSPR-524
EuthasolVirbacPVS111
Fio-guiaTerumoGR1804
IohexolThermoFisher466651000Contraste Iodado
Cetamina Biorbytorb61131
SoftwareLabChart ADInstruments
SpectrumLI102
MicrocateterMedtronicEV3 105-5056Microcateter Marathon
MicrofioMedtronicEV3 103-0608Mirage Microwire
PowerLab ADInstruments
Rabbit Brain 2mm Matriz de Corte CoronalTed Pella15026
SalineFisherScientific23-535435
BainhaMédicaMerit PSI-5F-11
Xylazine ThermoFisherJ61430.14
Lidocaína

Referências

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