Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

As células tumorais circulantes (CTCs) são significativas no prognóstico, diagnóstico e terapia anticâncer do câncer. A enumeração da CTC é vital, uma vez que as CTCs são raras e heterogêneas. A enumeração, a modificação da afinidade e a coloração clínica por imunofluorescência de CTCs raras são técnicas poderosas para o isolamento de CTC, pois oferecem os elementos necessários com alta^{sensibilidade1}. O número raro de células tumorais misturadas com sangue normal imita de perto o sangue real do paciente, uma vez que 2-3 mL de sangue real do paciente contém apenas 1-10 CTCs. Para resolver um problema experimental crítico, em vez de usar um grande número de células tumorais introduzidas em PBS ou misturadas com sangue normal, o uso de um número raro de células tumorais nos fornece um número baixo de células sanguíneas, o que é mais próximo da realidade ao realizar um experimento.

O câncer é a principal causa de morte no mundo². As CTCs são células tumorais eliminadas do tumor original que circulam nos sistemas de circulação sanguínea e linfática³. Quando os CTCs se movem para um novo ambiente de sobrevivência, eles crescem como um segundo tumor. Isso é chamado de metástase e é responsável por 90% das mortes em pacientes com^câncer4. As CTCs são vitais para o prognóstico, diagnóstico precoce e para a compreensão dos mecanismos do câncer. Entretanto, as CTCs são extremamente raras e heterogêneas no sangue dos pacientes ^5,6.

Os chips microfluídicos oferecem uma biópsia líquida que não invade o tumor. Eles têm a vantagem de serem portáteis, de baixo custo e terem uma escala compatível com células. O isolamento de CTCs com chips microfluídicos é classificado principalmente em dois tipos: baseado em afinidade, que se baseia na ligação antígeno-anticorpo7,8,9 e é o método original e mais amplamente utilizado de isolamento de CTC; e chips de base física, que utilizam diferenças de tamanho e deformabilidade entre células tumorais e células sanguíneas 10,11,12,13,14,15^, são livres de marcação e de fácil operação. A vantagem dos chips microfluídicos sobre as técnicas alternativas é que a abordagem física dos microfiltros de grande elipse captura firmemente os CTCs com alta eficiência de captura. A razão para isso é que os micropostes de elipse são organizados em túneis finos de lacunas de linha de linha. Os gaps de linha são diferentes dos tradicionais gaps ponto-ponto formados por micropostes, como micropostes losangos. A captura de CTCs baseada em chip de onda combina isolamento baseado em propriedades físicas e em afinidade. A captura baseada em chip de onda envolve 30 matrizes em forma de onda com o anticorpo de anti-EpCAM revestido em micropostes circulares. Os CTCs são capturados pelas pequenas folgas, e as grandes lacunas são usadas para acelerar a vazão. Os CTCs perdidos precisam passar pelas pequenas lacunas no próximo array e são capturados pelo isolamento baseado em afinidade integrado dentro do chip¹⁶.

O objetivo do protocolo é demonstrar a contagem de números raros de células tumorais e a análise clínica de CTCs com chips microfluídicos. O protocolo descreve as etapas de isolamento da CTC, como obter um baixo número de células tumorais, a separação física clínica de filtros de elipse pequena, filtros de elipse grande e filtros de trapézio, modificação de afinidade e enriquecimento¹⁷.

As amostras de sangue dos pacientes foram fornecidas pelo Longhua Hospital Afiliado à Universidade Médica de Xangai.O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim. Consentimento informado foi obtido dos pacientes para utilização das amostras para fins de pesquisa.

1. Pré-experimento para verificar a eficiência de captura com células tumorais cultivadas

1. Cultura das células tumorais MCF-7, MDA-MB-231 e HeLa para determinação da eficiência de captura. Diluir a suspensão de células tumorais, contar o número de células tumorais e repetir até obter o número desejado de células em 1 mL de PBS.
   1. Cultivar as células em frasco de cultura celular com número inicial de ~ 1 x 10,5 células em 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar numa atmosfera humidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO₂.
   2. Quando as linhagens celulares crescerem como monocamadas aderentes a 95% de confluência, retire-as das placas de cultura com solução de tripsina a 0,25% por 2 min, conforme descrito em Chen et ^al.16.
   3. Corar as células tumorais com calceína AM. Coloque 3 μL de calceína AM na placa de cultura e mantenha a placa na incubadora por 30 min. Em seguida, digerir todas as células com tripsina.
   4. Contar as células tumorais cultivadas em PBS com uma câmara de contagem de células e diluir até obter 100 células tumorais por 1 mL de PBS.
      NOTA: Para enumerar precisamente o número de células, tome 50 μL da suspensão celular obtida para ver se o número de células tumorais nela é cinco ou não com um microscópio. Decidir o volume de suspensão celular que precisa ser tomado para obter 100 células tumorais de acordo com o número real de células tumorais em 50 μL de suspensão celular.
2. Introduzir a suspensão celular contendo 100 células tumorais por 1 mL de PBS no chip microfluídico usando uma seringa com bomba de seringa a vazões variadas de 0,5 mL/h, 1 mL/h, 2 mL/h, 3 mL/h, 4 mL/h e 5 mL/h. Obtenha a eficiência de captura para as várias taxas de fluxo e determine a taxa de fluxo ideal.
   1. Conte o número de células tumorais capturadas no chip e que fluem para fora da saída. Calcule a eficiência de captura conforme abaixo:
      Eficiência de captura = Número de células capturadas/(Número de células capturadas + número de células fluindo) × 100%
   2. Repetir para obter a eficiência de captura para diferentes números de células tumorais de 10 a 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
3. Testar e validar o chip microfluídico para um número raro de células tumorais. Injetar essas 10 suspensões de amostra nos chips microfluídicos usando uma agulha oca feita com um extrator de micropipeta para aspirar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 células tumorais diluídas em 1 mL de PBS. Detectar e enumerar o número de células tumorais para cada amostra após sua captura no chip.
   NOTA: A agulha oca tem cerca de 3 cm de comprimento e 1 mm de diâmetro externo.
4. Realizar testes clínicos pré-experimento para células tumorais cravadas em amostras de sangue normais.
   1. Colorir as células tumorais com calceína AM e, em seguida, enumerar 100 células tumorais em 5 μL de PBS. Spike essas células em 1 mL de amostras de sangue normal total. Introduza essas células no chip e enumere o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência verde. Execute a enumeração in vivo no chip conforme descrito acima e calcule a eficiência de captura após a captura.
   2. Repetir o passo 1.4.1 para nove concentrações adicionais de números de células tumorais de 10 a 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
   3. Enumerar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 células tumorais conforme descrito na etapa 1.3 sem colorir, espícula em 1 mL de sangue normal total, introduzir essas amostras no chip microfluídico e capturar as células tumorais no chip.
   4. Manchar no chip com Hoechst, CK-FITC e CD45-PE. Coloque 3-5 μL de corante fluorescente em 20-30 μL de PBS e, em seguida, introduza esta solução no chip microfluídico com uma seringa. Enumere o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência azul e verde para determinar a eficiência de captura.
5. Realizar modificação do chip microfluídico para a captura baseada em afinidade de anti-EpCAM.
   NOTA: Como o chip de onda combina isolamento baseado em afinidade e em propriedades físicas, modifique o chip com agentes.
   1. Modificar a superfície do cavaco com 100 μL de 4% (v/v) de 3-mercaptopropil trimetoxisilano em etanol à temperatura ambiente durante 45 min. Introduza esta solução no cavaco com cuidado e lentamente, caso destrua a estrutura interna do cavaco, especialmente a colagem da superfície superior e do substrato de vidro.
      NOTA: A superfície do chip é modificada usando mercaptosilano. As interações que ocorrem no chip são determinadas por ligações químicas. Ligações químicas são estabelecidas para realizar a ligação do anticorpo modificado com o antígeno. Vários reagentes são modificados dentro do chip para estabelecer ligações químicas que se conectam entre si. O último reagente a ser modificado é uma molécula de adesão antiepitelial (anti-EpCAM). O antígeno de superfície celular tumoral da EpCAM combina com o anti-EpCAM dentro do chip para realizar a captura dos CTCs.
   2. Lave com etanol 3x. Adicionar 100 μL do agente de acoplamento N-y-maleimidobutiriloxi éster succinimida (GMBS, 1 μM) ao chip e deixá-lo interagir por 30 min.
   3. Lave com PBS 3x. Use uma seringa para introduzir 1 mL de PBS no chip para lavar.
   4. Trate o chip com 30-40 μL de 10 μg/mL neutravidin à temperatura ambiente por 30 min, levando à imobilização das células no GMBS, e então lave com PBS para remover o excesso de avidina.
   5. Modificar o chip com 3 μL de anticorpo anti-biotinilado EpCAM a uma concentração de 10 μg/mL em 100 μL de PBS com 1% (p/v) de BSA. Mantenha isso durante a noite.

2. Experimento clínico no chip para enumerar as células tumorais circulantes (CTCs)

1. Pré-processar amostras de sangue de pacientes com câncer clínico usando solução de lise de hemácias (RBCL) ou introduzir 2-3 mL da amostra de sangue diretamente no chip microfluídico usando uma seringa.
   1. Realizar o pré-processamento, que leva em torno de 30 min. Coletar amostras de sangue total em tubos de anticoagulação. Adicionar 6-9 mL de solução de lise RBS em 2-3 mL de sangue. Centrifugar a 111 x g por 5-8 min à temperatura ambiente e descartar a camada superior de líquido claro vermelho.
2. Capture, manche, reconheça e enumere as células no chip conforme descrito abaixo.
   1. Capture as células no chip conforme descrito na etapa 1.Manchar o chip para os CTCs capturados usando Hoechst, CK-FITC e CD45-PE. CK-FITC é uma coloração específica para células tumorais, e CD45-PE é para glóbulos brancos.
   2. Adicionar 3 μL de CK-FITC a 20 μL de PBS. Introduza-o na seringa e bombeie o CK-FITC diluído para o chip. Deixe manchar por 30 min. Introduza 300 μL de PBS no chip para lavar o chip.
   3. Adicionar 3 μL de CD45-PE a 20 μL de PBS. Introduza-o na seringa e bombeie o CD45-PE diluído para o chip. Deixe repousar por 30 min. Introduza 300 μL de PBS no chip para lavar o chip.
   4. Identificar as CTCs com microscópio de fluorescência invertido, com aumento de 20x ou 40x. Os CTCs emitem fluorescência azul e verde, e os glóbulos brancos (WBCs) emitem fluorescência azul e vermelha. Identifique os CTCs com fluorescência azul e verde e os leucócitos com fluorescência azul e vermelha.
   5. A partir das imagens de imunofluorescência, enumere o número de CTCs capturados no chip. Enumere os CTCs como Hoechst+/CK-FITC+/CD45− e os WBCs como Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
3. Enriqueça os CTCs capturados lavando com PBS através da seringa no sentido inverso no chip microfluídico para coletar os CTCs capturados no chip da entrada. Use uma seringa com 1 mL de PBS, introduza-a da saída para enriquecer os CTCs capturados no chip dentro de 2-3 min e colete-os da entrada. Use 1 mL de PBS para cada etapa de lavagem e repita 3x.
4. Manchar as células tumorais ou CTCs capturadas no chip microfluídico conforme descrito abaixo.
   1. Coloração com calceína AM. Adicionar 5 μL de calceína AM a 20 μL de PBS, corar as células por 30 min, em seguida, centrifugar a 111 x g por 2 min à temperatura ambiente para obter células tumorais e suspender em 1 mL de PBS.
   2. Para identificar os núcleos celulares, adicionar 20 μL de solução de DAPI (10 μL de reagente DAPI em 20 μL de PBS) ao chip na vazão ideal de 1 mL/h para microfiltros de elipse grande e 1,5 mL/h para microfiltros trapezoides. Passar por 20 μL de solução estoque anticitoqueratina (3 μL de anticorpo anticitoqueratina em 20 μL de PBS) para reagir com o chip por 30 min.
   3. Manchar os WBCs capturados no chip. Depois que os CTCs tiverem sido capturados no chip, adicione 25 μL de solução de anticorpo anti-CD45 (5 μL de solução anti-CD45 em 20 μL de PBS) ao chip e deixe manchar por 30 min. Lave com PBS e identifique as células epiteliais com fluorescência azul e verde.
5. Realizar a identificação por imunofluorescência com microscopia de fluorescência conforme descrito abaixo.
   1. Use um microscópio de fluorescência e excite a amostra com o laser azul. Encontre as células emissoras de fluorescência azul, que são células nucleadas. Use uma das seguintes ampliações: 10x, 20x ou 40x. Encontre um campo claro para a célula tumoral. Para a fonte de laser azul, use um comprimento de onda da placa de excitação de 420-485 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 515 nm.
   2. Sem mover as amostras, use outra fonte de laser. Gire o microscópio de fluorescência e excite a amostra com o laser verde. Encontre as células que emitem fluorescência verde, o que é indicativo de células tumorais. Tire fotos do mesmo campo com a mesma ampliação com esta fonte de laser verde. As células que emitem fluorescência azul e verde são reconhecidas como células tumorais. Para a fonte de laser verde, use um comprimento de onda da placa de excitação de 460-550 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 590 nm
   3. Sem mover as amostras, use outra fonte de laser. Gire o microscópio de fluorescência e excite a amostra com o laser vermelho. Encontre as células que emitem fluorescência vermelha. Tire imagens do mesmo campo com a mesma ampliação com esta fonte de laser vermelha. As células que emitem fluorescência azul e vermelha são reconhecidas como glóbulos brancos.
   4. Salve a imagem para obter usando cada uma das fontes de laser acima. Tire várias imagens do mesmo campo com luzes coloridas diferentes.
   5. Use luz ultravioleta com um comprimento de onda da placa de excitação de 330-400 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 425 nm. Use luz roxa com um comprimento de onda da placa de excitação de 395-415 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 455 nm.
6. Calcule a eficiência de captura como na etapa 1.2.1.

Toda a configuração inclui uma bomba de seringa, uma seringa e um chip microfluídico. A suspensão celular na seringa é conectada à bomba da seringa, e a suspensão da célula é introduzida no chip microfluídico para capturar as células. A eficiência de captura para todos os cavacos microfluídicos utilizados foi de cerca de 90% ou mais. Para o chip de onda, projetamos microestruturas com lacunas variadas. Os pequenos gaps são usados para capturar os CTCs, e os big gaps são usados para acelerar a taxa de fluxo. A suspensão da célula flui rapidamente nas grandes áreas de folga. As CTCs perdidas tendem a ser capturadas pelas pequenas lacunas na matriz subsequente16. Para chips de elipse, projetamos lacunas de linha em vez de lacunas de ponto para formar um túnel fino para melhorar a captura. Portanto, alta eficiência de captura foi alcançada1. Projetamos uma estrutura de elipse para evitar bordas e cantos para manter a viabilidade. Os filtros de trapézio possuem dois canais espirais circulares com barreiras de trapézio e micropós circulares embutidas. Para os filtros trapézios, as eficiências de captura para MCF-7, MDA-MB-231 e HeLa foram de 94%, 95% e 93%, respectivamente18.

A Figura 1 mostra que todas as células tumorais foram capturadas pelo chip de onda. Como todas as células tumorais estavam concentradas ao redor do arranjo de micropostes de onda, isso indica alta eficiência de captura para esse chip microfluídico, como demonstrado pelo número de células tumorais que foram capturadas. Portanto, essa configuração facilita muito a captura de células tumorais raras; Na verdade, o chip é fabricado para capturar um grande número de células tumorais, bem como um número raro de células tumorais. Por exemplo, se o chip é sólido ou reproduzível o suficiente para capturar 10.000 células tumorais, é fácil para o chip capturar 10-100 células. O vídeo 1 mostra como um número raro de células tumorais foi obtido para o pré-experimento. Uma agulha oca feita com extrator de micropipeta foi usada para aspirar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 células tumorais de uma placa de cultura com células tumorais diluídas coradas com calceína AM em PBS. As células foram absorvidas pelo tubo de sílica gel conectado à agulha oca. Uma célula tumoral com imunofluorescência verde foi aspirada para dentro da agulha oca. O sopro no tubo oco levou a célula tumoral dentro da agulha oca a ser descarregada em um tubo de microcentrífuga1. Este é o procedimento para obter células tumorais raras. A Figura 2 mostra as CTCs de um paciente com câncer gástrico capturadas com microfiltros de elipse pequena. A Figura 3 mostra as CTCs de um paciente com câncer colorretal capturadas com microfiltros trapézios e emitindo fluorescência azul e verde. A Figura 4 mostra as células tumorais cultivadas no chip após a captura, que estão prontas para serem tratadas com medicamentos anticâncer. Esses resultados ilustram que os microfiltros de elipse grande não têm efeitos negativos sobre a viabilidade celular.

A Figura 5 mostra a análise clínica por imunofluorescência das CTCs colorretais captadas no chip microfluídico. Estes são vistos em campo claro e corados com as colorações Hoechst, CK-FITC e CD45-PE. As CTCs foram reconhecidas como DAPI+/CK+/CD45−, e os leucócitos foram identificados como DAPI+/CK−/CD45+. A Figura 6 mostra células tumorais colorretais cultivadas no chip de elipse grande após a captura. A Figura 7 mostra as células tumorais colorretais capturadas nos microfiltros de elipse grande. Clinicamente, CTCs no sangue dos pacientes foram capturadas por chips de onda, microfiltros trapezoides e microfiltros de elipse grande, indicando que esses três chips são bem-sucedidos na captura de CTCs. Potencialmente, eles poderiam ser aplicados em produtos de CTC, como produtos de isolamento de CTC, com alta eficiência.

Figura 1: Captura de chip de onda. Todas as células tumorais do MCF-7 foram capturadas ao redor da matriz do chip de onda sem nenhuma célula ausente. Como não havia células tumorais em nenhuma outra área além da matriz, isso indica a alta eficiência de captura do chip. Um grande número de células tumorais foi capturado. Portanto, células tumorais raras também podem ser facilmente capturadas. As células tumorais do MCF-7 foram capturadas por chip de onda e (A) coradas com Hoechst e (B) coradas com calceína AM. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Amostra clínica para CTCs capturada por microfiltros de elipse pequena. CTCs clínicas de um paciente com câncer gástrico capturadas por microfiltros de elipse pequena. As CTCs foram identificadas em campo claro e com fluorescência azul e verde. O círculo azul em (A) indica uma CTC de um paciente com câncer gástrico capturada dentro do chip. Pelas imagens captadas, é possível perceber que não havia outras células em nenhuma outra área, indicando que a pureza de captura era alta para esse chip. Células tumorais de MCF-7 foram capturadas por microfiltros de elipse pequena e vistas em (A) campo claro, (B) corado com Hoechst e (C) corado com CK-FITC. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Amostra clínica de CTCs captada por microfiltros trapezoides. As CTCs clínicas de um paciente com câncer colorretal foram capturadas por microfiltros trapezoides. Nessas imagens, pode-se observar que seis CTCs foram capturadas, indicando que a eficiência de captura foi alta no campo pequeno. Além disso, nenhuma outra célula apareceu, indicando que a pureza de captura era extremamente alta para este chip. As células tumorais do MCF-7 foram capturadas por microfiltros trapezoides e vistas em (A) campo claro, (B) corado com Hoechst e (C) corado com CK-FITC. Barra de escala: 20 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Cultura de CTCs capturadas por microfiltros de elipse grande. As células tumorais de MCF-7 foram capturadas por microfiltros de elipse grande na frente de um arranjo de micropostes de elipse grande. Nenhuma célula tumoral passou pelo array, indicando alta eficiência de captura para este chip. Após a captura, as células tumorais cresceram por 24-48 h. Isso indica que tanto a eficiência de captura quanto a viabilidade foram muito altas para os microfiltros de elipse grande. As células tumorais cultivadas de MCF-7 foram capturadas por microfiltros de elipse grande e vistas em (A) 0 h após a captura, (B) 24 h após a captura e (C) 48 h após a captura. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Exemplo de amostra clínica utilizada para captação de CTC por microfiltros trapézios. As CTCs clínicas de um paciente com câncer colorretal foram capturadas por microfiltros trapezoides. Nessas imagens, pode-se observar que dois CTCs foram capturados, indicando alta eficiência de captura. Não houve outro distúrbio celular, exceto resíduos de hemácias no chip. Assim, para o pré-processamento clínico da captação da CTC, é melhor não utilizar lise de hemácias. CTCs de câncer colorretal foram capturados por microfiltros trapezoides e vistos em (A) campo claro, (B) corado com Hoechst, (C) corado com CK-FITC, e (D) visto em imagens mescladas. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Exemplo de CTCs cultivados capturados por um chip de elipse grande. Culturas de células tumorais de células MCF-7 na frente do arranjo de micropostes de elipse grande e atrás dos microfiltros de elipse grande. As células tumorais coradas com calceína AM emitindo fluorescência verde cresceram conforme desejado, indicando que a viabilidade celular para este chip era muito alta. No total, foram 15 arrays, com gaps variados para cada array organizados por micropostes de elipse grande. Células tumorais MCF-7 foram cultivadas no chip de elipse grande após captura (A) em um array e (B) em outro. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Exemplo de amostra clínica utilizada para captura de CTC por microfiltros de elipse grande. CTCs clínicas de um paciente com câncer colorretal foram capturadas por microfiltros de elipse grande. Pelas imagens, é possível ver que houve contaminação por hemácias. Isso indica que toda a amostra de sangue do paciente deve ser diluída e que o chip precisa ser lavado após a captura. CTCs de amostras clínicas de sangue de pacientes com câncer colorretal foram capturadas no chip de elipse grande e vistas em (A) campo claro, (B) corado com Hoechst e (C) corado com CK-FITC. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.