Name: Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a isolar células tumorais circulantes usando uma plataforma de chip microfluídico clínico. Este método simplifica o pré-processamento de amostras sanguíneas e permite a detecção rápida de CTCs individuais para diagnóstico oncológico.

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Este trabalho de pesquisa foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Anhui da China (1908085MF197, 1908085QB66), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (21904003), o Projeto de Pesquisa Científica da Comissão de Educação de Tianjin (2018KJ154), o Programa Provincial de Pesquisa em Ciências Naturais de Instituições de Ensino Superior da Província de Anhui (KJ2020A0239) e o Laboratório Chave de Xangai de Processamento de Informações Multidimensionais, Laboratório Chave de Informações Multidimensionais da China Oriental Processamento, Universidade Normal da China Oriental (MIP20221).

As amostras de sangue dos pacientes foram fornecidas pelo Longhua Hospital Afiliado à Universidade Médica de Xangai.O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim. Consentimento informado foi obtido dos pacientes para utilização das amostras para fins de pesquisa.
1. Pré-experimento para verificar a eficiência de captura com células tumorais cultivadas
<ol><li>Cultura das células tumorais MCF-7, MDA-MB-231 e HeLa para determinação da eficiência de captura. Diluir a suspensão de células tumorais, contar o número de células tumorais e repetir até obter o número desejado de células em 1 mL de PBS.<ol><li>Cultivar as células em frasco de cultura celular com número inicial de ~ 1 x 10,5 células em 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar numa atmosfera humidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2.</li>
		<li>Quando as linhagens celulares crescerem como monocamadas aderentes a 95% de confluência, retire-as das placas de cultura com solução de tripsina a 0,25% por 2 min, conforme descrito em Chen et al.16.</li>
		<li>Corar as células tumorais com calceína AM. Coloque 3 μL de calceína AM na placa de cultura e mantenha a placa na incubadora por 30 min. Em seguida, digerir todas as células com tripsina.</li>
		<li>Contar as células tumorais cultivadas em PBS com uma câmara de contagem de células e diluir até obter 100 células tumorais por 1 mL de PBS. NOTA: Para enumerar precisamente o número de células, tome 50 μL da suspensão celular obtida para ver se o número de células tumorais nela é cinco ou não com um microscópio. Decidir o volume de suspensão celular que precisa ser tomado para obter 100 células tumorais de acordo com o número real de células tumorais em 50 μL de suspensão celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Introduzir a suspensão celular contendo 100 células tumorais por 1 mL de PBS no chip microfluídico usando uma seringa com bomba de seringa a vazões variadas de 0,5 mL/h, 1 mL/h, 2 mL/h, 3 mL/h, 4 mL/h e 5 mL/h. Obtenha a eficiência de captura para as várias taxas de fluxo e determine a taxa de fluxo ideal.<ol><li>Conte o número de células tumorais capturadas no chip e que fluem para fora da saída. Calcule a eficiência de captura conforme abaixo: Eficiência de captura = Número de células capturadas/(Número de células capturadas + número de células fluindo) × 100%</li>
		<li>Repetir para obter a eficiência de captura para diferentes números de células tumorais de 10 a 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).</li>
	</ol></li>
	<li>Testar e validar o chip microfluídico para um número raro de células tumorais. Injetar essas 10 suspensões de amostra nos chips microfluídicos usando uma agulha oca feita com um extrator de micropipeta para aspirar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 células tumorais diluídas em 1 mL de PBS. Detectar e enumerar o número de células tumorais para cada amostra após sua captura no chip. NOTA: A agulha oca tem cerca de 3 cm de comprimento e 1 mm de diâmetro externo.</li>
	<li>Realizar testes clínicos pré-experimento para células tumorais cravadas em amostras de sangue normais.<ol><li>Colorir as células tumorais com calceína AM e, em seguida, enumerar 100 células tumorais em 5 μL de PBS. Spike essas células em 1 mL de amostras de sangue normal total. Introduza essas células no chip e enumere o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência verde. Execute a enumeração in vivo no chip conforme descrito acima e calcule a eficiência de captura após a captura.</li>
		<li>Repetir o passo 1.4.1 para nove concentrações adicionais de números de células tumorais de 10 a 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).</li>
		<li>Enumerar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 células tumorais conforme descrito na etapa 1.3 sem colorir, espícula em 1 mL de sangue normal total, introduzir essas amostras no chip microfluídico e capturar as células tumorais no chip.</li>
		<li>Manchar no chip com Hoechst, CK-FITC e CD45-PE. Coloque 3-5 μL de corante fluorescente em 20-30 μL de PBS e, em seguida, introduza esta solução no chip microfluídico com uma seringa. Enumere o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência azul e verde para determinar a eficiência de captura.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar modificação do chip microfluídico para a captura baseada em afinidade de anti-EpCAM. NOTA: Como o chip de onda combina isolamento baseado em afinidade e em propriedades físicas, modifique o chip com agentes.<ol><li>Modificar a superfície do cavaco com 100 μL de 4% (v/v) de 3-mercaptopropil trimetoxisilano em etanol à temperatura ambiente durante 45 min. Introduza esta solução no cavaco com cuidado e lentamente, caso destrua a estrutura interna do cavaco, especialmente a colagem da superfície superior e do substrato de vidro. NOTA: A superfície do chip é modificada usando mercaptosilano. As interações que ocorrem no chip são determinadas por ligações químicas. Ligações químicas são estabelecidas para realizar a ligação do anticorpo modificado com o antígeno. Vários reagentes são modificados dentro do chip para estabelecer ligações químicas que se conectam entre si. O último reagente a ser modificado é uma molécula de adesão antiepitelial (anti-EpCAM). O antígeno de superfície celular tumoral da EpCAM combina com o anti-EpCAM dentro do chip para realizar a captura dos CTCs.</li>
		<li>Lave com etanol 3x. Adicionar 100 μL do agente de acoplamento N-y-maleimidobutiriloxi éster succinimida (GMBS, 1 μM) ao chip e deixá-lo interagir por 30 min.</li>
		<li>Lave com PBS 3x. Use uma seringa para introduzir 1 mL de PBS no chip para lavar.</li>
		<li>Trate o chip com 30-40 μL de 10 μg/mL neutravidin à temperatura ambiente por 30 min, levando à imobilização das células no GMBS, e então lave com PBS para remover o excesso de avidina.</li>
		<li>Modificar o chip com 3 μL de anticorpo anti-biotinilado EpCAM a uma concentração de 10 μg/mL em 100 μL de PBS com 1% (p/v) de BSA. Mantenha isso durante a noite.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Experimento clínico no chip para enumerar as células tumorais circulantes (CTCs)
<ol><li>Pré-processar amostras de sangue de pacientes com câncer clínico usando solução de lise de hemácias (RBCL) ou introduzir 2-3 mL da amostra de sangue diretamente no chip microfluídico usando uma seringa.<ol><li>Realizar o pré-processamento, que leva em torno de 30 min. Coletar amostras de sangue total em tubos de anticoagulação. Adicionar 6-9 mL de solução de lise RBS em 2-3 mL de sangue. Centrifugar a 111 x g por 5-8 min à temperatura ambiente e descartar a camada superior de líquido claro vermelho.</li>
	</ol></li>
	<li>Capture, manche, reconheça e enumere as células no chip conforme descrito abaixo.<ol><li>Capture as células no chip conforme descrito na etapa 1.Manchar o chip para os CTCs capturados usando Hoechst, CK-FITC e CD45-PE. CK-FITC é uma coloração específica para células tumorais, e CD45-PE é para glóbulos brancos.</li>
		<li>Adicionar 3 μL de CK-FITC a 20 μL de PBS. Introduza-o na seringa e bombeie o CK-FITC diluído para o chip. Deixe manchar por 30 min. Introduza 300 μL de PBS no chip para lavar o chip.</li>
		<li>Adicionar 3 μL de CD45-PE a 20 μL de PBS. Introduza-o na seringa e bombeie o CD45-PE diluído para o chip. Deixe repousar por 30 min. Introduza 300 μL de PBS no chip para lavar o chip.</li>
		<li>Identificar as CTCs com microscópio de fluorescência invertido, com aumento de 20x ou 40x. Os CTCs emitem fluorescência azul e verde, e os glóbulos brancos (WBCs) emitem fluorescência azul e vermelha. Identifique os CTCs com fluorescência azul e verde e os leucócitos com fluorescência azul e vermelha.</li>
		<li>A partir das imagens de imunofluorescência, enumere o número de CTCs capturados no chip. Enumere os CTCs como Hoechst+/CK-FITC+/CD45− e os WBCs como Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.</li>
	</ol></li>
	<li>Enriqueça os CTCs capturados lavando com PBS através da seringa no sentido inverso no chip microfluídico para coletar os CTCs capturados no chip da entrada. Use uma seringa com 1 mL de PBS, introduza-a da saída para enriquecer os CTCs capturados no chip dentro de 2-3 min e colete-os da entrada. Use 1 mL de PBS para cada etapa de lavagem e repita 3x.</li>
	<li>Manchar as células tumorais ou CTCs capturadas no chip microfluídico conforme descrito abaixo.<ol><li>Coloração com calceína AM. Adicionar 5 μL de calceína AM a 20 μL de PBS, corar as células por 30 min, em seguida, centrifugar a 111 x g por 2 min à temperatura ambiente para obter células tumorais e suspender em 1 mL de PBS.</li>
		<li>Para identificar os núcleos celulares, adicionar 20 μL de solução de DAPI (10 μL de reagente DAPI em 20 μL de PBS) ao chip na vazão ideal de 1 mL/h para microfiltros de elipse grande e 1,5 mL/h para microfiltros trapezoides. Passar por 20 μL de solução estoque anticitoqueratina (3 μL de anticorpo anticitoqueratina em 20 μL de PBS) para reagir com o chip por 30 min.</li>
		<li>Manchar os WBCs capturados no chip. Depois que os CTCs tiverem sido capturados no chip, adicione 25 μL de solução de anticorpo anti-CD45 (5 μL de solução anti-CD45 em 20 μL de PBS) ao chip e deixe manchar por 30 min. Lave com PBS e identifique as células epiteliais com fluorescência azul e verde.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar a identificação por imunofluorescência com microscopia de fluorescência conforme descrito abaixo.<ol><li>Use um microscópio de fluorescência e excite a amostra com o laser azul. Encontre as células emissoras de fluorescência azul, que são células nucleadas. Use uma das seguintes ampliações: 10x, 20x ou 40x. Encontre um campo claro para a célula tumoral. Para a fonte de laser azul, use um comprimento de onda da placa de excitação de 420-485 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 515 nm.</li>
		<li>Sem mover as amostras, use outra fonte de laser. Gire o microscópio de fluorescência e excite a amostra com o laser verde. Encontre as células que emitem fluorescência verde, o que é indicativo de células tumorais. Tire fotos do mesmo campo com a mesma ampliação com esta fonte de laser verde. As células que emitem fluorescência azul e verde são reconhecidas como células tumorais. Para a fonte de laser verde, use um comprimento de onda da placa de excitação de 460-550 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 590 nm</li>
		<li>Sem mover as amostras, use outra fonte de laser. Gire o microscópio de fluorescência e excite a amostra com o laser vermelho. Encontre as células que emitem fluorescência vermelha. Tire imagens do mesmo campo com a mesma ampliação com esta fonte de laser vermelha. As células que emitem fluorescência azul e vermelha são reconhecidas como glóbulos brancos.</li>
		<li>Salve a imagem para obter usando cada uma das fontes de laser acima. Tire várias imagens do mesmo campo com luzes coloridas diferentes.</li>
		<li>Use luz ultravioleta com um comprimento de onda da placa de excitação de 330-400 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 425 nm. Use luz roxa com um comprimento de onda da placa de excitação de 395-415 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 455 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcule a eficiência de captura como na etapa 1.2.1.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-sensitive+capture+of+circulating+tumor+cells+using+micro-ellipse+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters.</a> Scientific Reports. 7 (1), 610(2017).</li>
<li>World Health Organization Cancer report. , Available from: 
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<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).</li>
<li>Mehlen, P., Puisieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+A+question+of+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: A question of life or death.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).</li>
<li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-selective+collection+of+circulating+tumor+cells+using+Vortex+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+patients+with+localized+and+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (25), 23(2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Nagrath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumor+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Murlidhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radial+flow+microfluidic+device+for+ultra-high-throughput+affinity-based+isolation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells.</a> Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).</li>
<li>Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdevice+for+the+isolation+and+enumeration+of+cancer+cells+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood.</a> Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).</li>
<li>Preira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+circulating+cell+sorting+by+deformability+using+a+microfluidic+gradual+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter.</a> Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).</li>
<li>Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+microfluidics+combined+with+active+and+passive+approaches+for+continuous+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation.</a> Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).</li>
<li>Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumour+cells+by+physical+means+in+a+microfluidic+device%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review.</a> RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).</li>
<li>Kumeria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoswitchable+membranes+based+on+peptide-modified+nanoporous+anodic+alumina%3A+Toward+smart+membranes+for+on-demand+molecular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport.</a> Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).</li>
<li>Mahesh, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+platform+for+physical+and+immunological+detection+and+capture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells.</a> Biosensors. 12 (4), 220(2022).</li>
<li>Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+antibody-coated%2C+physical-based+microfluidic+chip+with+wave-shaped+arrays+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells.</a> Biomedical Microdevices. 19 (3), 66(2017).</li>
<li>Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+circulating+tumour+cell+enrichment+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A review of circulating tumour cell enrichment technologies.</a> Cancers. 13 (5), 970(2021).</li>
<li>Chen, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inertia-deformability+hybrid+CTC+chip%3A+Design%2C+clinical+test+and+numerical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Devices%22%5BJournal%5D)">An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study.</a> Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O prognóstico e o diagnóstico precoce do câncer têm efeito significativo no tratamento do câncer1. O isolamento do CTC com chips microfluídicos oferece uma biópsia líquida sem invasão. No entanto, as CTCs são extremamente raras e heterogêneas no sangue1, o que torna difícil isolar as CTCs. As CTCs têm propriedades semelhantes às fontes tumorais originais das quais se originam. Assim, as CTCs desempenham um papel vital na metástase docâncer1. 
<p ...

As células tumorais circulantes (CTCs) são significativas no prognóstico, diagnóstico e terapia anticâncer do câncer. A enumeração da CTC é vital, uma vez que as CTCs são raras e heterogêneas. A enumeração, a modificação da afinidade e a coloração clínica por imunofluorescência de CTCs raras são técnicas poderosas para o isolamento de CTC, pois oferecem os elementos necessários com altasensibilidade1. O número raro de células tumorais misturadas com sangue normal imita de perto o sangue real do paciente, uma vez que 2-3 mL de sangue real do paciente contém apenas 1-10 CTCs. Para resolver um problema experimental crítico, em vez de usar um grande número de células tumorais introduzidas em PBS ou misturadas com sangue normal, o uso de um número raro de células tumorais nos fornece um número baixo de células sanguíneas, o que é mais próximo da realidade ao realizar um experimento.
O câncer é a principal causa de morte no mundo2. As CTCs são células tumorais eliminadas do tumor original que circulam nos sistemas de circulação sanguínea e linfática3. Quando os CTCs se movem para um novo ambiente de sobrevivência, eles crescem como um segundo tumor. Isso é chamado de metástase e é responsável por 90% das mortes em pacientes comcâncer4. As CTCs são vitais para o prognóstico, diagnóstico precoce e para a compreensão dos mecanismos do câncer. Entretanto, as CTCs são extremamente raras e heterogêneas no sangue dos pacientes 5,6.
Os chips microfluídicos oferecem uma biópsia líquida que não invade o tumor. Eles têm a vantagem de serem portáteis, de baixo custo e terem uma escala compatível com células. O isolamento de CTCs com chips microfluídicos é classificado principalmente em dois tipos: baseado em afinidade, que se baseia na ligação antígeno-anticorpo7,8,9 e é o método original e mais amplamente utilizado de isolamento de CTC; e chips de base física, que utilizam diferenças de tamanho e deformabilidade entre células tumorais e células sanguíneas 10,11,12,13,14,15, são livres de marcação e de fácil operação. A vantagem dos chips microfluídicos sobre as técnicas alternativas é que a abordagem física dos microfiltros de grande elipse captura firmemente os CTCs com alta eficiência de captura. A razão para isso é que os micropostes de elipse são organizados em túneis finos de lacunas de linha de linha. Os gaps de linha são diferentes dos tradicionais gaps ponto-ponto formados por micropostes, como micropostes losangos. A captura de CTCs baseada em chip de onda combina isolamento baseado em propriedades físicas e em afinidade. A captura baseada em chip de onda envolve 30 matrizes em forma de onda com o anticorpo de anti-EpCAM revestido em micropostes circulares. Os CTCs são capturados pelas pequenas folgas, e as grandes lacunas são usadas para acelerar a vazão. Os CTCs perdidos precisam passar pelas pequenas lacunas no próximo array e são capturados pelo isolamento baseado em afinidade integrado dentro do chip16.
O objetivo do protocolo é demonstrar a contagem de números raros de células tumorais e a análise clínica de CTCs com chips microfluídicos. O protocolo descreve as etapas de isolamento da CTC, como obter um baixo número de células tumorais, a separação física clínica de filtros de elipse pequena, filtros de elipse grande e filtros de trapézio, modificação de afinidade e enriquecimento17.

<table><tbody><tr><td>Calceína AM</td><td>BIOTIUM</td><td>80011</td><td></td></tr><tr><td>pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P0799</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CK-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347653</td><td>anticorpo monoclonal de citoqueratina</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30081.05</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino (FBS)</td><td>GIBCO, EUA</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondas Moleculares, Solarbio Corp., China</td><td>C0031</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Ying Biotecnologia confiável, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lise de glóbulos vermelhos (RBCL)</td><td>Solarbio, Pequim</td><td>R1010</td><td></td></tr></tbody></table>

plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

As células tumorais circulantes (CTCs) são significativas no prognóstico, diagnóstico e terapia anticâncer do câncer. A enumeração da CTC é vital na determinação da doença do paciente, uma vez que as CTCs são raras e heterogêneas. As CTCs são descoladas do tumor primário, entram no sistema de circulação sanguínea e potencialmente crescem em locais distantes, metastatizando o tumor. Como as CTCs carregam informações semelhantes às do tumor primário, o isolamento da CTC e sua posterior caracterização podem ser fundamentais no monitoramento e diagnóstico do câncer. A enumeração, modificação de afinidade e coloração clínica por imunofluorescência de CTCs raras são métodos poderosos para o isolamento de CTC, pois fornecem os elementos necessários com alta sensibilidade. Os chips microfluídicos oferecem um método de biópsia líquida que é livre de qualquer dor para os pacientes. Neste trabalho, apresentamos uma lista de protocolos para chips microfluídicos clínicos, uma versátil plataforma de isolamento CTC, que incorpora um conjunto de funcionalidades e serviços necessários para a separação, análise e diagnóstico precoce da CTC, facilitando assim a análise biomolecular e o tratamento do câncer. O programa inclui contagem de células tumorais raras, pré-processamento clínico de sangue de pacientes, que inclui lise de hemácias, e o isolamento e reconhecimento de CTCs in situ em chips microfluídicos. O programa permite a enumeração precisa de células tumorais ou CTCs. Além disso, o programa inclui uma ferramenta que incorpora isolamento CTC com chips microfluídicos versáteis e identificação de imunofluorescência in situ nos chips, seguida de análise biomolecular.

Toda a configuração inclui uma bomba de seringa, uma seringa e um chip microfluídico. A suspensão celular na seringa é conectada à bomba da seringa, e a suspensão da célula é introduzida no chip microfluídico para capturar as células. A eficiência de captura para todos os cavacos microfluídicos utilizados foi de cerca de 90% ou mais. Para o chip de onda, projetamos microestruturas com lacunas variadas. Os pequenos gaps são usados para capturar os CTCs, e os big gaps são usados para acelerar a taxa de fluxo. A suspensão d...

O chip microfluídico clínico é uma importante técnica de análise biomédica que simplifica o pré-processamento de amostras de sangue de pacientes clínicos e cora por imunofluorescência as células tumorais circulantes (CTCs) in situ no chip, permitindo a rápida detecção e identificação de uma única CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

Este protocolo descreveu um método para a enumeração de hemácias tumorais e o isolamento clínico da CTC. Para começar, cultivar as células tumorais MCF-7, MDA-MB-231 e HeLa em frasco de cultura celular de uma vez 10 a quinto em um milímetro de DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Quando as linhagens celulares crescerem como monocamadas aderentes a 95% de confluência, retire-as da placa de cultura com solução de tripsina a 0,25% por dois minutos. Manchar as células tumorais adicionando três microlitros de Calcein AM e colocar a placa na incubadora por 30 minutos. No final da incubação, digerir todas as células com tripsina.Contar as células tumorais de cultura em PBS com uma câmara de contagem de células e diluir até obter 100 células tumorais por mililitro de PBS. Em seguida, introduza a suspensão de células diluídas no chip microfluídico usando uma seringa com uma bomba de seringa em taxas de fluxo variadas. Obtenha a eficiência de captura para as várias taxas de fluxo e determine a taxa de fluxo ideal.Conte o número de células tumorais capturadas no chip e que fluem da saída. Calcule a eficiência de captura usando a fórmula fornecida. Repetir o procedimento para obter a eficiência de captura para diferentes números de células tumorais, de 10 a 100.Testar e validar o chip microfluídico para um número raro de células tumorais. Injete essas 10 suspensões de amostra nos chips microfluídicos usando uma agulha oca feita com um extrator de micropipeta para aspirar células tumorais diluídas. Detectar e enumerar o número de células tumorais para cada amostra após sua captura no chip.Em seguida, corar as células tumorais com Calcein AM e enumerar 100 células tumorais em cinco microlitros de PBS. Spike essas células em um mililitro de amostra de sangue inteiro e normal. Introduza essas células no chip e enumere o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência verde.Execute a enumeração in vivo conforme descrito e calcule a eficiência de captura após a captura. Enumerar de uma a 10 células tumorais sem colorir. Spike essas células em um mililitro de sangue total e normal.Introduza essas amostras no chip microfluídico e capture as células tumorais. Adicione três a cinco microlitros de corante fluorescente em 20 a 30 microlitros de PBS e introduza esta solução no chip com uma seringa. Enumerar o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência azul e verde para determinar a eficiência de captura.Em seguida, modifique a superfície do chip com 100 microlitros de trimetoxisilano 4%3-mercaptopropil e etanol à temperatura ambiente por 45 minutos para a captura baseada em afinidade da molécula de adesão de células antiepiteliais. Ao final da incubação, lave o cavaco três vezes com etanol. Em seguida, adicione 100 microlitros do agente de acoplamento GMBS e deixe interagir por 30 minutos.No final da incubação, use uma seringa para lavar o chip três vezes com um mililitro de PBS. Trate o chip com 30 a 40 microlitros de 10 microgramas por mililitro neutravidin à temperatura ambiente por 30 minutos, levando à imobilização das células no GMBS, e depois lave com PBS para remover o excesso de avidina. Modifique o chip com três microlitros de anticorpo anti-molécula de adesão de células epiteliais biotiniladas e incube durante a noite.Todas as células tumorais foram capturadas ao redor da matriz do chip de onda sem nenhuma célula ausente, indicando a alta eficiência de captura do chip microfluídico. Células tumorais coradas com Hoechst e Calcein AM são mostradas aqui. CTCs de um paciente com câncer gástrico capturados usando pequenos microfiltros de elipse são mostrados aqui.Além disso, CTCs de um paciente com câncer colorretal capturados usando microfiltros trapézios, e emitindo fluorescência azul e verde, são mostrados. Alta eficiência de captura e viabilidade foram observadas para células tumorais capturadas usando microfiltros de elipse grande. A análise clínica por imunofluorescência das CTCs colorretais capturadas no chip microfluídico reconheceu as CTCs como DAPI-positivas, CK-positivas, CD45-negativas e os leucócitos como DAPI-positivos, CK-negativos, CD45-positivos.Células tumorais colorretais cultivadas no chip de elipse grande após a captura, e células tumorais colorretais capturadas nos microfiltros de elipse grande são mostradas aqui. Este método de modificação com aptâmero fornece uma nova abordagem para enriquecer o isolamento da CTC.

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Bioengenharia

Células tumorais circulantes são isolados a partir do sangue de pacientes com cancro sem causar danos celulares. Isolamento de células tumorais é realizada usando uma superfície bimolecular da E-selectina para além de anticorpos contra marcadores epiteliais. Um revestimento de nanotubo especificamente promove a adesão de células cancerosas, resultando em purezas de captura elevadas.

Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células únicas com uma plataforma microfluídica, que utiliza um novo conceito de design de micropoços para permitir o isolamento de célula única de alta eficiência e cultura clonal de longo prazo.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Este protocolo descreve a funcionalização de superfície personalizável do sistema de destiobiotina, estreptavidina e APTES para isolar tipos específicos de células de interesse. Além disso, este manuscrito cobre as aplicações, otimização e verificação desse processo.

Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

Um protocolo para utilizar um poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro revestido para captura e libertação eficaz thermoresponsive de células viáveis tumorais circulantes (CTC) é apresentada. Este método permite a captura de CTC de sangue dos pacientes e posterior liberação dos CTC viável para a cultura off-chip jusante, análises e caracterização.

Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.

Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

As células tumorais circulantes (CTCs) são críticas para o estudo da progressão e metástase do câncer. Este artigo apresenta um protocolo integrado de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de CTC única, melhorando a eficiência de captura e a pureza da CTC, reduzindo os custos de contaminação e sequenciamento, avançando assim na pesquisa de oncologia de precisão e aplicações clínicas.

Tecnologia de Classificação de Células Tumorais Circulantes de Alto Rendimento e Tecnologia de Sequenciamento de Célula Única Baseada em Microfluídica

Aprenda a isolar células tumorais circulantes usando uma plataforma de chip microfluídico clínico. Este método simplifica o pré-processamento de amostras sanguíneas e permite a detecção rápida de CTCs individuais para diagnóstico oncológico.

Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

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