O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.

Resumo

Os transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF) são caracterizados por um conjunto altamente variável de defeitos estruturais e prejuízos cognitivos que surgem devido à exposição pré-natal ao etanol. Devido à complexa patologia do TEAF, modelos animais têm se mostrado críticos para nossa compreensão atual dos defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol. O peixe-zebra provou ser um modelo poderoso para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol devido ao alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento entre peixes-zebra e humanos. Como um sistema modelo, o peixe-zebra possui muitos atributos que os tornam ideais para estudos de desenvolvimento, incluindo um grande número de embriões fertilizados externamente que são geneticamente tratáveis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem com precisão o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em vários contextos genéticos. Uma importante ferramenta genética disponível no peixe-zebra é a transgênese. No entanto, gerar construções transgênicas e estabelecer linhagens transgênicas pode ser complexo e difícil. Para resolver essa questão, os pesquisadores do peixe-zebra estabeleceram o sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon. Este sistema modular usa uma abordagem de clonagem de Gateway multisite para a montagem rápida de construções transgênicas completas baseadas em transposon Tol2. Aqui, descrevemos a caixa de ferramentas do sistema flexível Tol2 e um protocolo para geração de construções transgênicas prontas para a transgênese de peixe-zebra e seu uso em estudos de etanol.

Introdução

A exposição pré-natal ao etanol dá origem a um continuum de déficits estruturais e comprometimentos cognitivos denominados transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF)^1,2,3,4. As complexas relações entre múltiplos fatores tornam o estudo e a compreensão da etiologia do TEAF em humanos um desafio. Para resolver esse desafio, uma grande variedade de modelos animais tem sido utilizada. As ferramentas biológicas e experimentais disponíveis nesses modelos têm se mostrado cruciais no desenvolvimento de nossa compreensão das bases mecanicistas da teratogenicidade do etanol, e os resultados desses sistemas modelo têm sido notavelmente consistentes com o que é encontrado em estudos com etanol humano ^5,6. Dentre estes, o zebrafish tem emergido como um poderoso modelo para o estudo da teratogênese do etanol7,8, em parte devido à sua fecundação externa^, alta fecundidade, tratabilidade genética e embriões translúcidos. Esses pontos fortes se combinam para tornar o peixe-zebra ideal para estudos de imagem ao vivo em tempo real do FASD usando linhas transgênicas de peixe-zebra.

O peixe-zebra transgênico tem sido extensivamente utilizado para estudar múltiplos aspectos do desenvolvimento embrionário⁹. No entanto, criar construções transgênicas e linhas transgênicas subsequentes pode ser extremamente difícil. Um transgene padrão requer um elemento promotor ativo para conduzir o transgene e um sinal poli A ou "cauda", tudo em um vetor bacteriano estável para manutenção geral do vetor. A geração tradicional de uma construção transgênica multicomponente requer várias etapas demoradas de subclonagem¹⁰. Abordagens baseadas em PCR, como a montagem Gibson, podem contornar alguns dos problemas associados à subclonagem. No entanto, primers únicos devem ser projetados e testados para a geração de cada construção transgênica única¹⁰. Além da construção de transgenes, a integração genômica, a transmissão germinativa e a triagem para a integração adequada de transgenes também têm sido difíceis. Descrevemos aqui um protocolo para utilização do sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon (Tol2Kit)^10,11. Este sistema modular usa clonagem de Gateway multissite para gerar rapidamente várias construções transgênicas a partir de uma biblioteca em constante expansão de vetores de "entrada" e "destino". Os elementos transponíveis integrados Tol2 aumentam consideravelmente a taxa de transgênese, permitindo a rápida construção e integração genômica de múltiplos transgenes. Usando este sistema, mostramos como a geração de uma linhagem de zebrafish transgênico endoderme pode ser usada para estudar os defeitos estruturais tecido-específicos subjacentes ao TEAF. Em última análise, neste protocolo, mostramos que a configuração modular e a construção de construções transgênicas ajudarão muito a pesquisa de FASD baseada em peixe-zebra.

Protocolo

Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram criados e criados seguindo os protocolos estabelecidos pela IACUC¹². Esses protocolos foram aprovados pela Universidade de Louisville.

NOTA: A linhagem de peixe-zebra selvagem, AB, e a linhagem dupla mutante bmp4^st72;smad5^b1100 foram usadas neste estudo. Toda a água utilizada neste procedimento foi água de osmose reversa estéril. As imagens confocais foram obtidas em microscópio confocal de varredura a laser. As medidas da endoderme foram realizadas utilizando-se a ferramenta de medida do ImageJ. Todas as análises estatísticas foram realizadas por meio de software estatístico.

1. Fazendo as soluções e mídias

1. Meio bacteriano: Dissolver o caldo LB ou ágar conforme as instruções do fabricante, e autoclave. Antes de despejar o meio em placas de Petri de 100 mm, adicione ampicilina (50 μg/mL), canamicina (50 μg/mL) ou uma combinação de ampicilina/cloranfenicol (50 μg/mL e 30 μg/mL, respectivamente).
2. Para fazer 20x estoque de meio embrionário, dissolver o seguinte em 1 L de água: 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl 2, 0,41 g de K 2 HPO 4, 0,142 g de Na 2 HPO 4 e 4,9 g de MgSO₄·7H ₂O. Filtrar-esterilizar a solução-mãeusando um sistema de filtração a vácuo de 0,22 μm, e armazenar a 4 °C.
   NOTA: Ignore o precipitado branco que se forma; isso não vai impactar a mídia.
3. Em 19 L de água, dissolver 1,2 g de NaHCO₃ e adicionar 1 L do stock de 20x de meios embrionários para gerar a solução de meio embrionário de trabalho e manter esta solução a 28 °C.
4. Para solução de vermelho de fenol a 2%, dissolver 20 mg de sal de sódio vermelho de fenol em 1 mL de água livre de RNase e armazenar à temperatura ambiente.

2. Moldes de injeção de embriões

1. Para fazer a placa de injeção de agarose, dissolver a agarose no meio embrionário até uma concentração final de 3% aquecendo para ferver.
2. Despeje 50 mL de agarose em placas de Petri de 100 mm e, enquanto a agarose ainda estiver líquida, coloque suavemente o molde de injeção na agarose para evitar a formação de bolhas sob o molde.
3. Deixe as placas de agarose esfriar. Quando a agarose estiver sólida, remova o molde de injeção e guarde a 4 °C até estar pronto para usar.

3. Pipetas de injeção

1. Puxe os capilares de 1,0 mm (OD) contendo um filamento em agulhas usando um extrator de pipeta vertical com o solenoide ajustado para 2,5 e o elemento de aquecimento ajustado para 14,6.
   NOTA: Qualquer extrator aquecido funcionará se puxar os capilares em duas agulhas de forma limpa e uniforme, mas as agulhas de injeção precisam ser puxadas dentro de 1 semana após a injeção dos embriões de peixe-zebra para resultados consistentes da injeção.
   1. Coloque o capilar no puxador, aperte a braçadeira em cada extremidade e, em seguida, ative o elemento de aquecimento.
   2. Puxe os capilares para criar duas agulhas de injeção.
   3. Retire os capilares do puxador e guarde-os em uma placa de Petri vazia com uma tira de argila modeladora que atua como suporte da agulha.

4. Preparação de mRNA de transposase

1. Linearizar o plasmídeo Tol2Kit contendo transposase com uma endonuclease de restrição NotI, combinando o seguinte em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL: 10 μL de plasmídeo transposase (150 ng/μL), 1,5 μL de tampão de reação de endonuclease de restrição, 0,3 μL de endonuclease NotI.
2. Encha a reação até 20 μL com água sem RNase e, em seguida, misture e digerir a 37 °C durante a noite.
3. Pare a digestão da transposase adicionando 1 μL de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 2 μL de 5 M NH₄OAc e 80 μL de 100% de EtOH à reação de digestão e, em seguida, misture e resfrie a -20 °C durante a noite.
4. Centrifugar a solução a 14.000x g durante 20 min a 4 °C e, em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender a pastilha de ADN em água isenta de RNase.
5. Determinar a concentração de plasmídeo linear em nanogramas por microlitro (ng/μL) usando um fluorômetro executando primeiro 2 μL de um branco de água livre de RNase e, em seguida, executando 2 μL do plasmídeo linearizado.
   NOTA: As concentrações plasmidiais normalmente variam entre 100-200 ng/μL
6. Configure a produção de mRNA do SP6 combinando os seguintes componentes em ordem em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL: 10 μL de 2x NTP/CAP, 2 μL de tampão de reação 10x, 0,1-1 μg de molde de DNA linear e 2 μL de mistura enzimática SP6.
7. Encher a reação até 20 μL com água sem RNase e, em seguida, misturar e incubar a 37 °C por 2 h.
8. Após incubar por 2 h, adicionar 1 μL de DNase, misturar bem e incubar por mais 15 min a 37 °C.
9. Para interromper a reação SP6, adicione 30 μL de solução de precipitação de LiCl ao tubo de reação e, em seguida, misture e resfrie a -20 °C durante a noite.
10. Centrifugar a solução a 14.000 x g por 20 min a 4 °C para pellet do mRNA, aspirar o sobrenadante e lavar o pellet de mRNA com 1 mL de EtOH 80% (diluído com água livre de RNase).
11. Centrifugar a solução a 14.000 x g durante 20 minutos a 4 °C para pelar o mRNA e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Deixe o pellet secar ao ar.
12. Ressuspender a pastilha de mRNA em 20 μL de água livre de RNase, determinar a concentração de mRNA em nanogramas por microlitro (ng/μL) usando um fluorômetro conforme descrito na etapa 4.5 (deve ser de pelo menos 100 ng/μL), alíquota de 100 ng de mRNA por tubo para uso único e armazenar a −80 °C.
    NOTA: Para garantir que o mRNA não seja degradado, 2 μL de mRNA podem ser executados rapidamente em um gel de eletroforese de DNA para confirmar uma única banda a 1.950 bps.

5. Clonagem de Multisite Gateway para criar vetores de entrada para transgênese

NOTA: Este protocolo é modificado de Kwan et ^al.10, com a reação LR escrita como uma reação de meio LR e com um volume total de 5 μL. Para gerar novos elementos de entrada, é necessário utilizar reações de PB utilizando vetores doadores de 5', meio e 3'^10,13.

1. Para realizar a reação, reúna 10 fmol cada de p5E, pME e p3E e 20 fmol do vetor de destino (pDest).
   NOTA: A recombinação de LR multissítio usa quatro vetores plasmidiais diferentes: um vetor de entrada de 5' (p5E), um vetor de entrada do meio (pME), um vetor de entrada de 3' (p3E) e um vetor de destino (pDest), para gerar uma construção transgênica única flanqueada por repetições de Tol2 prontas para serem injetadas em embriões de peixe-zebra.
   1. Identifique o tamanho de todos os quatro vetores em pares de bases da fonte de plasmídeo (Tabela 1, Tol2Kit Wiki página¹⁴ ou Addgene¹¹; veja a Tabela de Materiais).
      NOTA: Para novos vetores, o sequenciamento completo de plasmídeos por meio de empresas de sequenciamento comercial pode fornecer o tamanho exato do plasmídeo em bps.
   2. Determinar a concentração dos quatro vectores em nanogramas por microlitro (ng/μL) utilizando um fluorómetro, conforme descrito no passo 4.5.
   3. Usando o peso do DNA como 660 g/mol e o tamanho do plasmídeo (em bps), calcule o total de nanogramas (ng) de plasmídeo necessários para atingir 10 fmol (vetores de entrada) ou 20 fmol (vetor de destino).
      
      NOTA: O laboratório Mosimann da Universidade do Colorado, Anschutz Medical Campus, gerou uma planilha disponível gratuitamente para calcular a quantidade de plasmídeo necessária (em ng) e o volume (em μL) dos vetores necessários na reação LR¹⁵.
2. Para gerar a construção descrita abaixo, sox17: EGFPCAAX, use os seguintes vetores: um vetor p5E contendo o promotor zebrafish sox17 , que é 6.918 pb no tamanho¹⁶; um vetor pME contendo o EGFP prenilado, que é de 3.345 pb no tamanho¹⁰; um vetor p3E contendo a sequência de sinal SV40 late poly A, que é de 2.838 pb no tamanho¹⁰; e o pDest, que tem 5.883 pb no tamanho¹⁰.
3. Usando a concentração de plasmídios determinada na etapa 5.1.2 e a quantidade em nanogramas (ng) para cada vetor (etapa 5.1.3), calcule o total de microlitros (μL) de cada plasmídeo necessário para atingir 10 fmol (vetores de entrada) ou 20 fmol (vetor de destino) e, em seguida, divida isso por dois para uso nas reações de 5 μL de meio LR (todos os valores listados abaixo estão listados na Tabela 2).
   
   1. Para gerar 10 fmol de p5E-sox17, use 45,66 ng (na concentração de 140,3 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 4 para obter 0,65 μL.
   2. Para gerar 10 fmol de pME-EGFPCAAX, use 22,08 ng (a uma concentração de 213,5 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 10 para obter 0,52 μL.
   3. Para gerar 10 fmol de p3E-poly A, use 15,73 ng (na concentração de 276,1 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 20 para obter 0,57 μL.
   4. Para 20 fmol do vetor de destino, use 77,66 ng de pDest (a uma concentração de 307,3 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 5 para obter 1,63 μL.
4. Para estabelecer uma reação de 5 μL de meio-LR, combine os volumes de p5E, pME, p3E e pDest determinados na etapa 5.3 em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL e, em seguida, adicione água estéril para atingir um volume total de reação de 4 μL.
5. Vórtice vigorosamente a mistura enzimática LR 2x por 1 min cada para garantir a mistura adequada e, em seguida, adicione 1 μL à reação e misture completamente.
6. Incubar a 25 °C durante a noite (16+ h).
7. Parar a reação LR adicionando 0,5 μL de proteinase K (2 μg/μL), incubar a 37 °C por 10 min e arrefecer até à temperatura ambiente.
8. Transformar 3-4 μL de plasmídeo em células descongeladas e quimicamente competentes, adicionando o plasmídeo e deixando as células ficarem no gelo por 25-30 min.
9. Enquanto as células ficam no gelo, aqueça duas placas de ágar LB-ampicilina à temperatura ambiente.
10. Choque térmico das células em banho-maria a 42°C por precisamente 30 s.
11. Após o choque térmico, adicionar 250 μL de meio líquido rico e livre de antibióticos às células e incubar com agitação a 37 °C por 1,5 h.
12. Espalhe 300 μL de bactérias em uma placa de ampicilina e incube a 37°C durante a noite.
13. Na manhã seguinte, rastrear as colônias quanto à presença de dois fenótipos, claro e opaco, escolher as colônias claras (como descrito em Kwan et ^al.10), uma de cada vez, inocular a cultura líquida e, em seguida, agitar a 37 °C durante a noite.
    NOTA: Colônias claras quase sempre contêm a colônia LR correta (>85% das vezes).
14. Usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante, execute uma preparação de plasmídio em cada cultura líquida e digere diagnóstica cada plasmídeo para confirmar o tamanho apropriado da construção transgênica, o que indica que a reação de gateway LR funcionou corretamente.
15. Re-transformar as construções transgênicas corretas usando o protocolo padrão de transformação bacteriana como descrito nas etapas 5.4-5.12 usando 0,5-1 μL do plasmídeo, e incubar apenas a 37 °C por 1 h.
16. Re-estriar as colônias e confirmar que cada uma tem a construção transgênica LR como na etapa 5.14.
17. Determinar a concentração plasmidial conforme descrito na etapa 4.5 (pelo menos 150 ng/μL são necessários para a injeção do embrião).

6. Injeção do transgene nos embriões

1. Descongelar uma amostra de mRNA transposase de uso único e a construção transgênica de Tol2 no gelo e pré-avisar uma placa de injeção de agarose à temperatura ambiente.
2. Combinar o seguinte no gelo: 150 ng de plasmídeo, 100 ng de mRNA de transposase e 2% de vermelho de fenol (0,3 μL). Em seguida, adicione água livre de RNA para completar o volume de 3 μL.
3. Transfira embriões em estágio celular usando pipetas de transferência para a placa de injeção (descrita na etapa 2) preenchida com EM cobrindo completamente o ágar e, em seguida, pressione suavemente aproximadamente 50-75 embriões por slot da placa de injeção.
4. Adicione a mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol à extremidade aberta de uma agulha de injeção capilar, coloque a agulha capilar na armadura do equipamento de injeção e ligue o equipamento de injeção.
   NOTA:A plataforma de injeção usa gás comprimido, como ar, para pulsar o volume desejado (descrito na etapa 6.5) da mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol no embrião quando ativado.
5. Abaixe a agulha capilar para o EM da placa de injeção e quebre a ponta usando pinça para permitir que apenas uma pequena quantidade de mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol seja bombeada para fora pelo equipamento de injeção.
6. Injetar os embriões com um pequeno bolus de 3 nL da mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol no corpo celular do embrião.
   NOTA: Um bolus de 3 nL é um volume de mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol no qual sete bolus podem teoricamente se encaixar igualmente na linha média do embrião.
7. Quando terminar de injetar os embriões, remova-os da placa de injeção, retirando-os suavemente da ranhura e transferindo-os para uma placa de Petri de 100 mm com EM fresco (aproximadamente 40 mL) e, em seguida, incube a 28,5 °C para permitir que os embriões se desenvolvam.

7. Triagem de embriões para inserção transgênica

1. Para a expressão de proteínas fluorescentes, escolher o estágio de desenvolvimento apropriado em que o transgene fluorescente deve ser expresso e rastrear a presença de fluorescência em um microscópio dissecante fluorescente.
   OBS: Estes embriões serão mosaicos em sua expressão e apresentarão uma inserção genômica da construção transgênica.
2. Triagem de transgenes não fluorescentes por triagem de um marcador transgênico fluorescente (conforme descrito na etapa 7.1), como GFP conduzido pelo promotor cardíaco-específico para o gene cmlc2 ou mCherry impulsionado pelo promotor específico da lente de αcyrstallin, que estão contidos em vetores de destino distintos.
3. Permitir que os embriões positivos para inserção transgênica se desenvolvam completamente até os estágios de peixe-zebra adulto.
4. Uma vez que os peixes transgênicos potenciais atinjam a idade de reprodução, selecione-os individualmente para transmissão germinativa e expressividade transgênica, reproduzindo-os para peixes-zebra selvagens.
5. Os adultos cujos embriões se desenvolvem normalmente e dão a expressão transgênica mais forte e apropriada são mantidos como linhagens únicas de peixes-zebra transgênicos para futuros trabalhos e análises.
   NOTA: Como uma abordagem alternativa para a triagem para a inserção genômica de construções transgênicas, projete primers de PCR que apenas amplificam a construção transgênica e não o DNA selvagem.

Resultados

Para gerar as construções transgênicas, foi utilizado o sistema de transgênese Tol2. Três vetores de entrada, incluindo p5E, que contém os elementos promotores/potencializadores do gene, pME, que mantém o gene a ser expresso pelos elementos promotores/intensificadores, e p3E, que, no mínimo, contém a cauda poliA, foram usados para gerar a construção transgênica via clonagem LR de gateway multissite. O vetor de destino, pDest, fornece as repetições de Tol2 para a inserção genômica da construção transgênica em emb...

Discussão

Os peixes-zebra são ideais para estudar o impacto da exposição ao etanol no desenvolvimento e estados de doença ^7,8. Os peixes-zebra produzem um grande número de embriões translúcidos, fertilizados externamente e geneticamente tratáveis, o que permite a obtenção de imagens vivas de vários tecidos e tipos celulares marcados com transgenes simultaneamente em múltiplos contextos ambientais^19,20. Esses pontos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caixa de ferramentas Addgene Tol2	https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Ar			Fornecido diretamente pela universidade
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760
Balança Analítica	VWR	10204-962
Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID Capilar	FHC	30-30-0
Cloreto de cálcio	VWR	97062-590
Cloranfenicol	BioVision	2486
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
Microscópio de dissecação fluorescente	Olympus	SZX16
Kanamicina	Fisher Scientific	BP906
Microscópio confocal de varredura a laser	Olympus	Fluoview FV1000
Lawson Lab Doador Plasmídeo Preparação	https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB	Agar Fisher Scientific	BP9724
LB Caldo	Fisher Scientific	BP1426
Baixo-EEO/Multiuso/Biologia Molecular Grau Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
LR Enzima Clonase II Plus	Fisher Scientific	12538200
Magnésio (Heptahidratado)	Fisher Scientific	M63-500
Micro Pipeta porta-Pipeta	Instrumentação	Científica Aplicada MIMPH-M-PIP
Tubo de Microcentrífuga 0.5 mL	VWR	10025-724
Tubo de microcentrífuga 1.5 mL	VWR	10025-716
Micromanipulador	Instrumentação Científica Aplicada	MM33
Pontas de micropipeta 10 μ L	Fisher Scientific	13611106
Pontas de Micropipeta 1000 μ L	Fisher Scientific	13611127
Pontas de Micropipeta 200 μ L	Fisher Scientific	13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6	Planilha de Cálculo Fisher Scientific	AM1340
Mosimann Lab Tol2	https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
Espectrofotômetro NanoDrop	NanoDrop	ND-1000
NcoI	NEB	R0189S
NotI	NEB	R0189S
Placas de Petri 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Sal de sódio vermelho de fenol	Sigma Aldrich	P4758-5G
Micropipeta Pipetman L p1000L	Gilson	FA10006M
Micropipeta Pipetman L p200L Gilson		FA10005M
Micropipeta Pipetman L p2L	Gilson	FA10001M
Cloreto de potássio	Fisher Scientific	P217-500
Fosfato de potássio (dibásico)	VWR	BDH9266-500G
Injetor de pressão	Instrumentação científica aplicada	MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Bicarbonato de sódio	VWR	BDH9280-500G
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	S271-500
Fosfato de Sódio (Dibásico)	Fisher Scientific	S374-500
Stericup .22 µ M Sistema de Filtração a Vácuo	Página Wiki da Millipore	SCGPU11RE
Tol2	http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Quimicamente Competentes E. coli	Fisher Scientific	C404010
Extrator de Pipetter Vertical	David Kopf Instruments	720
Molde de microinjeção de peixe-zebra	Ferramentas de Ciência Adaptativa	i34