As tecnologias CRISPR-Cas revolucionaram o campo da edição do genoma. No entanto, encontrar e isolar a edição de linha germinal desejada continua sendo um grande gargalo. Portanto, este protocolo descreve um método robusto para rastrear rapidamente espermatozoides de peixe-zebra injetados com CRISPR F0 para edições germinativas usando técnicas padrão de PCR, digesto de restrição e eletroforese em gel.
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Artigo de método
Triagem de espermatozoides para o isolamento rápido de edições germinativas em peixes-zebra
Neste artigo
Resumo
Resumo
O advento de tecnologias nucleases CRISPR-Cas direcionadas revolucionou a capacidade de realizar a edição precisa do genoma em sistemas modelo estabelecidos e emergentes. Os sistemas de edição do genoma CRISPR-Cas usam um RNA guia sintético (sgRNA) para direcionar uma endonuclease associada a CRISPR (Cas) para loci específicos de DNA genômico, onde a endonuclease de Cas gera uma quebra de fita dupla. O reparo de quebras de fita dupla por mecanismos intrínsecos propensos a erros leva a inserções e/ou deleções, interrompendo o locus. Alternativamente, a inclusão de doadores de DNA de fita dupla ou oligonucleotídeos de DNA de fita simples nesse processo pode provocar a inclusão de edições precisas do genoma variando de polimorfismos de nucleotídeo único a pequenas etiquetas imunológicas ou mesmo grandes construções de proteínas fluorescentes. No entanto, um grande gargalo nesse procedimento pode ser encontrar e isolar a edição desejada na linha germinativa. Este protocolo descreve um método robusto para triagem e isolamento de mutações germinativas em loci específicos em Danio rerio (zebrafish); no entanto, esses princípios podem ser adaptáveis em qualquer modelo onde a coleta de espermatozoides in vivo seja possível.
Introdução
O sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas é uma ferramenta poderosa para realizar mutagênese loci-específica e edição precisa do genoma no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) 1,2,3,4. A Cas-ribonucleoproteína (RNP) é composta por dois componentes principais: uma endonuclease Cas (comumente Cas9 ou Cas12a) e um RNA guia sintético locus-específico (sgRNA)5. Juntos, os Cas-RNP geram uma quebra de fita dupla (DSB) no locus desejado que pode ser reparada por um dos dois me....
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Protocolo
Este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas em Austin (AUP-2021-00254).
1. Projetando o sgRNA para mutagênese CRISPR
- Obtenha a sequência de éxons contendo os loci visados.
- Projetar um RNA guia sintético (sgRNA) com um sítio de motivo adjacente (PAM) do protoespaçador que seja específico para a endonuclease de Cas.
- Se co-injetar uma construção doadora, projete o sgRNA para ter um local de corte previsto o mais próx....
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Resultados
As abordagens experimentais descritas neste protocolo permitem a identificação mais rápida de edições do genoma ou alelos deletérios putativos, concentrando-se na análise de milhares de genomas derivados da coleção de espermatozoides masculinos injetados com F0. A Figura 2 destaca como interpretar os resultados obtidos com esse protocolo.
Para gerar mutações no locus p2ry12, embriões de zebrafish em estágio unicelular foram injetados com endonuclease Cas9 e um sgR.......
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Discussão
Este protocolo descreve um método para caracterizar rapidamente edições do genoma putativo ou mutações direcionadas usando a tecnologia CRISPR-Cas por análise focada em genomas de espermatozoides masculinos F0. Este protocolo deve ser acessível a outros modelos animais em que os espermatozoides estejam prontamente disponíveis para amostragem sem eutanásia. Esse método aumentará a taxa de transferência de triagem para edições desejadas e é especialmente útil para identificar eventos raros mediados por HDR. Essa abordagem .......
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Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Anna Hindes, da Escola de Medicina da Universidade de Washington, por seus esforços iniciais na obtenção de DNA genômico de espermatozoides de boa qualidade usando o método hot shot. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob Prêmio (R01AR072009 a R.S.G.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pó de agarose | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Tanques de Reprodução | Carolina Biological | ||
| Enzima de Restrição BstNI | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | ||
| construção doadora dnah10 | Sigma-Aldrich | DNA Oligo em Tubo; 0.025 nM, purificação de dessalinização padrão, seco. Ligação fosforotioato no doador nas três primeiras ligações fosfato nas extremidades 5' e 3' (5'-CCTCTCTCTCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') | |
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo em Tubo; 0.025 nM, purificação padrão de dessalinização, seco (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') | |
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo em Tubo; 0.025 nM, purificação padrão de dessalinização, seco ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') | |
| dnah10 sgRNA sintético | Synthego | SgRNA sintético, sequência alvo: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Fonte | |
| alimentação para eletroforese | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Pinça de filtro | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (sistema) água | Genérico | n/a | |
| Sistema de eletroforese em gel (incluindo estrutura de fundição, pente e câmara de eletroforese) | Thermo Scientific | Caixa | |
| Azure Biosystems | AZI200-01 | ||
| Mancha em gel, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| , 250 mL | Tanques de | genéricos n/a | |
| , 0,8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap tubo capilar com lâmpada, 20 µ L | Micropipetas Minicentrífugas Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Bio-Rad | 12011919EDU | ||
| , várias com pontas apropriadas | Genérica | n/a | |
| Micro-ondas | Genérico | n/a | |
| Água livre de nuclease | Promega | P119-C | |
| Toalhas de papel | Tubos PCR genéricos | n/a | |
| , 0,2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Colher de plástico, com furos/ranhuras perfurados | Solução genérica | n/a | |
| KCl, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo em Tubo; 0.025 nM, purificação de dessalinização padrão, seco (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') | |
| p2ry12 primer reverso | Sigma-Aldrich | DNA Oligo em Tubo; 0.025 nM, purificação de dessalinização padrão, seco (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') | |
| p2ry12 sgRNA sintético | Synthego | SgRNA sintético, sequência alvo: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Enzima | |
| Restrição 10X Tampão | NEB | B6003SVIAL | |
| solução de NaOH, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Esponja, corte de 1 polegada x 1 polegada com pequeno divot oval | Genérico | n/a | |
| Estereomicroscópio | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polimerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Termociclador | Bio-Rad | 1861096 | |
| Papel de seda | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Solução de tricaína-metanossulfonato (Syncaine, MS-222), 0,016% em água de peixe (pH 7,0± 0.2) | Base Tris Syndel | 200-266 | |
| , 1M (Tamponado com HCl para ph 8.0) | Promega | H5131 |
Referências
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient ....
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Reimpressões e permissões
