Artigo de método

HPLC Juntamente com Impressão Digital Química para Reconhecimento de Multi-Padrões para Identificar a Autenticidade de Clematidis Armandii Caulis

DOI:

10.3791/64690

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11 de novembro de 2022

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1School of Pharmacy, The Second Class Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutics, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Chengdu Medical College, 2Pengzhou Second People's Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), juntamente com o reconhecimento químico de multi-padrão de impressão digital, que fornece uma nova estratégia para identificar efetivamente as variedades genuínas de Clematidis Armandii Caulis e seus adulterantes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um método para identificar materiais medicinais chineses e seus adulterantes relacionados foi construído tomando Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, uma medicina tradicional chinesa universalmente usada) como exemplo. Dez lotes de variedades genuínas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes relacionados foram analisados e comparados com base nas impressões digitais de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) combinadas com quimiometria, incluindo análise de cluster (CA), análise de componentes principais (PCA) e análise ortogonal parcial de discriminação de mínimos quadrados (OPLS-DA). Além disso, o teor de β-sitosterol foi determinado. A impressão digital química de controle de Chuanmutong foi estabelecida, e 12 picos comuns foram identificados. A semelhança entre a impressão digital de 10 lotes de variedades Chuanmutong genuínas e a impressão digital de controle foi de 0,910-0,989, enquanto a similaridade de cinco lotes de adulterantes foi de apenas 0,133-0,720. Com base nos picos comuns no cromatograma, 15 lotes de amostras foram classificados em três níveis de conteúdo por PCA, e foram agregados em quatro categorias por CA, alcançando uma clara distinção entre Chuanmutong autêntico e adulterantes de Chuanmutong. Além disso, sete componentes diferenciais que podem efetivamente identificar Chuanmutong autênticos e adulterantes de Chuanmutong foram encontrados através do OPLS-DA. O teor de β-sitosterol de 10 lotes de variedades genuínas de Chuanmutong foi de 97,53-161,56 μg/g, enquanto o teor de β-sitosterol dos cinco lotes de adulterantes variou muito, entre os quais o teor de β-sitosterol de Clematis peterae Hand.-Mazz. e Clematis gouriana Roxb. Fintii Rehd. et Wils. foi significativamente menor do que a das variedades autênticas de Chuanmutong. O conteúdo do componente do índice HPLC e o método de reconhecimento multipadrão de impressão digital química estabelecido neste estudo fornecem uma nova estratégia para identificar efetivamente materiais medicinais chineses autênticos e adulterantes relacionados.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chuanmutong, Caulis seco de Clematis armandii Franch. ou Clematis montana Buch.-Ham., é uma medicina tradicional chinesa comumente utilizada em clínicas 1,2,3. É utilizado para o tratamento de problemas urinários, edema, feridas na língua e na boca, diminuição da secreção de leite, rigidez articular e dores musculares causadas pelo calor úmido4. Chuanmutong sempre foi obtido a partir de variedades silvestres, distribuídas principalmente no sudoeste da China, especialmente em Sichuan, onde a melhor qualidade pode ser encontrada 5,6. É difícil distinguir entre variedades autênticas e seus adulterantes intimamente relacionados devido às suas características semelhantes 7,8,9,10. O padrão de qualidade de Chuanmutong na edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa estipula apenas as propriedades, a identificação microscópica e a identificação de camada fina sem determinação de conteúdo, que não podem efetivamente identificar os adulterantes e, portanto, têm riscos potenciais. Além disso, há poucos relatos comparando e identificando Chuanmutong e plantas relacionadas. Consequentemente, um método de controle de qualidade para garantir a autenticidade de Chuanmutong é digno de um estudo mais aprofundado.

Os constituintes químicos do Chuanmutong são compostos principalmente de triterpenóides pentacíclicos do tipo oleanona e seus glicosídeos, flavonoides e ácidos orgânicos11,12,13,14. Dentre eles, o ácido oleanólico, o β-sitosterol, o estigmasterol e o ergosterol têm efeitos diuréticos de diferentes intensidades, o que pode ser potencial substância farmacodinâmica para promover a diurese e aliviar a estrangulia15,16. As impressões digitais químicas são obtidas separando e detectando muitos componentes químicos contidos em amostras por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia gasosa (GC), etc. A adoção de métodos de análise estatística adequados para analisar as características de Chuanmutong pode determinar o controle geral de qualidade e a identificação científica da medicina tradicional chinesa17,18,19.

Neste estudo, foram coletados 10 lotes de variedades autênticas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes. Sua qualidade foi comparada e analisada pelo método de impressão digital por HPLC combinado com reconhecimento de múltiplos padrões, incluindo análise de cluster (AC), análise de componentes principais (PCA), análise ortogonal parcial de discriminação de mínimos quadrados (OPLS-CA) e determinação de conteúdo do componente farmacodinâmico. Este protocolo estabelece um método para identificar variedades autênticas com alta especificidade, uma nova estratégia para a identificação científica de variedades autênticas e adulterantes de materiais medicinais chineses.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Métodos de detecção química de impressões digitais

  1. Condições cromatográficas
    1. Preparar a fase móvel acetonitrila (A)/água (B). Defina um programa de gradiente da seguinte forma no software HPLC: 0-20 min, 3%A-10%A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
    2. Manter a vazão da fase móvel em 1,0 mL/min.
    3. Efectuar a separação cromatográfica numa coluna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantida a 30 °C.
    4. Ajuste o volume de injeção para 10 μL.
    5. Detectar as amostras a um comprimento de onda de 205 nm.
      NOTA: Para as configurações específicas das condições cromatográficas, consulte os procedimentos operacionais do software de trabalho de cromatografia líquida de alta eficiência (Tabela de Materiais).
  2. Preparação da solução da amostra
    1. Moer as matérias-primas para um tamanho de partícula uniforme, passando-as através de uma malha de nylon com um diâmetro interno de 850 μm ± 29 μm.
    2. Colocar 2 g da matéria-prima moída (ponderada com precisão) num balão cónico de 50 ml com uma rolha e adicionar 50 ml de metanol. Colocar a rolha no balão e o ultrassom (600 W, 40 kHz) durante 30 minutos.
    3. Em seguida, arrefecer o balão à temperatura ambiente (RT). Pese novamente as amostras e compense o peso inicial substituindo o extrator perdido.
    4. Deitar 4 ml da solução de metanol contendo os extractos medicinais num balão aferido de 10 ml. Adicione 6 mL de H2O, misture e deixe descansar por 10 min.
    5. Finalmente, filtre o sobrenadante através de uma membrana filtrante de 0,45 μm e coloque-o em modo de espera.
  3. Validação de métodos de detecção de impressões digitais
    1. Preparar a amostra conforme descrito acima (etapa 1.2) e submetê-la à análise por HPLC (etapa 1.1) seis vezes ao dia. Para avaliar a precisão, calcule o desvio padrão relativo (RSD) do tempo de retenção relativo e das áreas de pico relativas, conforme descrito na etapa 1.3.5.
    2. Avaliar a estabilidade da solução de amostra analisando a mesma solução de amostra armazenada no RT por 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h, e calcular o RSD do tempo relativo de retenção e das áreas de pico relativas, conforme descrito na etapa 1.3.5.
    3. Recolher seis repetições da mesma amostra (CMT-4), preparar a solução da amostra de acordo com o procedimento acima referido (passo 1.2) e detectar a sua impressão digital em HPLC seguindo o passo 1.1. Calcule a DSR do tempo relativo de retenção e das áreas de pico relativas e avalie a sua repetibilidade conforme descrito no passo 1.3.5.
    4. Em seguida, use o pico número 10 na Figura 1B como o pico de referência e calcule o RSD do tempo de retenção relativo e da área de pico relativa de cada pico comum, conforme descrito na etapa 1.3.5.
    5. Use as fórmulas mencionadas abaixo para calcular o tempo de retenção relativo e a área de pico relativa de cada pico comum:
      T re = T característica/Treferência
      A re = Umacaracterística/Areferência
      Onde T re = tempo de retenção relativo, T característica = tempo de retenção de pico característico, T referência = tempo de retenção de pico de referência, A re = área de pico relativa, A característica = área de pico característica e A referência = área de pico de referência.
      NOTA: O estabelecimento de impressões digitais da medicina tradicional chinesa geralmente requer a seleção de um pico cromatográfico que seja fácil de obter e tenha alta resolução. Isso é usado como um pico de referência para identificar as impressões digitais e examinar sua estabilidade e reprodutibilidade.

2. Estabelecimento da impressão digital de Chuanmutong e análise de similaridade

  1. Use 10 lotes de amostras autênticas e cinco lotes de adulterantes, como Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. Fintii Rehd. et Wils (XS), e Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) como amostras para análise de impressões digitais.
  2. Preparar as soluções de exemplo conforme descrito na etapa 1.2. Efectuar a análise das impressões digitais de todas as soluções de amostras por HPLC de acordo com as condições descritas no passo 1.1.
  3. Importar os dados relevantes para o sistema de avaliação de similaridade de impressões digitais cromatográficas da medicina tradicional chinesa (SESCF-TCM, versão 2012). O sistema designará os picos com altura razoável e boa resolução nos cromatogramas de todas as amostras como picos comuns.
    NOTA: O software SESCF-TCM pode ser descarregado após o registo no sítio Web da Comissão da Farmacopeia Chinesa (http://114.247.108.158:8888/login).
    1. No software, clique no botão Definir espectro de referência no menu.
    2. Em seguida, na janela Configurações de parâmetro, defina a largura da janela de tempo como 0,5 e selecione Método de geração de espectro de controle como o método mediano.
    3. Clique em Calibração Multiponto no menu principal e selecione Correspondência de Pico como Correspondência de Pico de Espectro Completo.
    4. Finalmente, clique em Gerar Controle para gerar a impressão digital cromatográfica de referência da autêntica espécie de Chuanmutong.
  4. Importe o tempo de retenção e a área de pico de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes para o SESCF-TCM para análise. As operações específicas são as seguintes:
    1. No software, clique no botão Definir espectro de referência no menu principal.
    2. Na janela Configurações de parâmetros , defina a impressão digital cromatográfica de referência da espécie autêntica de Chuanmutong como referência, selecione o Método de Geração de Espectro de Controle como o Método Mediano e defina a Largura da Janela de Tempo como 0,5.
    3. Clique em Calibração Multiponto no menu principal e selecione Correspondência de Pico como Correspondência de Pico de Espectro Completo.
    4. Finalmente, clique em Calcular Similaridade para calcular a semelhança com base nas impressões digitais de cromatograma de referência de Chuanmutong. Finalmente, calcule a semelhança das impressões digitais usando o Sistema de Avaliação Cromatográfica de Impressões Digitais da Medicina Chinesa (versão 2012).
      NOTA: Para as operações específicas, consulte as especificações operacionais para o Sistema de Avaliação de Impressões Digitais Cromatográficas de Medicina Chinesa (versão 2012).

3. Análise de reconhecimento de múltiplos padrões da impressão digital de Chuanmutong

  1. Análise de cluster (AC)
    1. Use as áreas de pico de 12 picos comuns nas impressões digitais de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e seus cinco lotes de adulterantes como variáveis e insira-as em um software de análise estatística para análise sistemática de cluster (CA).
    2. Escolha o método Between-Groups e use o coeficiente de correlação de Pearson como base de classificação para desenhar um diagrama de análise de cluster de Chuanmutong e seus adulterantes. As operações específicas são as seguintes:
      1. No software de análise estatística, clique em Arquivo para importar dados.
      2. Clique em Análise no menu e, em seguida, clique em Clustering do Sistema em Classificação.
      3. Selecione a área de pico comum como uma variável e defina o número de clusters como quatro.
      4. Clique em Método, selecione o método de agrupamento como Conexão entre Grupos, selecione o intervalo de medição como Correlação de Pearson e clique em OK para desenhar o mapa da AC.
  2. Análise de componentes principais (ACP)
    1. Importe a área de pico comum relativa das variedades autênticas e seus adulterantes para o software de análise para análise de PCA e use o mapa de pontuação de PCA para avaliar o mapa de matriz de pontuação das diferenças amostrais. As operações específicas são as seguintes:
      1. Abra o software de análise de dados, clique em Arquivo no menu e crie um novo projeto regular. Importe a área de pico de 12 picos comuns em uma planilha (por exemplo, formato Excel) do sistema HPLC. Em seguida, clique em Concluir para concluir a importação de dados.
      2. Clique em Novo para criar um novo modelo para definir o tipo de modelo com PCA. Clique em Autofit e Add para ajustar os dados e, em seguida, clique em Scores para obter o mapa de pontuação PCA.
  3. Análise ortogonal parcial de discriminação de mínimos quadrados (OPLS-DA)
    1. Use o método de análise de discriminação de mínimos quadrados parciais ortogonais com modo de supervisão para analisar melhor os picos relativos da área de pico comum das variedades e adulterantes Chuanmutong autênticos e desenhar um mapa de pontuação de classificação OPLS-DA de todas as amostras. As operações específicas são as seguintes:
      1. No software de análise de dados, clique em Arquivo no menu para importar um arquivo e criar um novo projeto regular. Importe a área de pico de 12 picos comuns em uma planilha do sistema HPLC e clique em Concluir para concluir a importação de dados.
      2. Clique em Novo para criar um novo modelo para definir o tipo de modelo com PCA. Clique em Autofit e Add para ajustar os dados. Em seguida, clique em Pontuações para obter o mapa de pontuação PCA.
      3. Clique em Novo e escolha Novo como Modelo Um para definir o tipo de modelo com OPLS-DA.
      4. Clique em Dimensionar e defina o tipo com Par para Todos. Clique em Autofit primeiro e, em seguida, clique em Scores para obter o mapa de pontuação OPLS-DA.
    2. A fim de determinar a influência de cada pico comum em Chuanmutong em seus resultados de classificação e a diferença entre materiais autênticos de Chuanmutong e adulterantes relacionados, use a variável importância na projeção (VIP) para análise.
    3. Desenhe o mapa VIP dos diferentes componentes de Chuanmutong. Use o mapa VIP resultante para avaliar o impacto de cada variável na classificação e para filtrar os componentes que contribuem significativamente para as diferenças entre os grupos. As operações específicas são as seguintes:
      1. No software de análise de dados, clique em Analisar no menu e clique em Permutações, defina o número de permutações para 200 e obtenha o R 2 e o Q2 do mapa de pontuação OPLS-DA.
      2. Clique em VIP e escolha VIP Predictive para obter o mapa VIP.

4. Determinação do β-sitosterol em Chuanmutong por HPLC

  1. Condições cromatográficas (ver etapa 1.1)
    1. Prepare a fase móvel: metanol-água (97:3).
    2. Defina a taxa de fluxo da fase móvel para 1,0 mL/min.
    3. Efectuar a separação cromatográfica numa coluna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantida a 30 °C.
    4. Ajuste o volume de injeção para 10 μL.
    5. Detecte o componente em um comprimento de onda de 204 nm.
  2. Preparação da solução da amostra
    1. Preparar a solução-mãe padrão de β-sitosterol (0,1 mg/ml) dissolvendo uma quantidade ponderada com precisão do padrão de referência correspondente em metanol.
    2. Moer a amostra de análise da matéria-prima até uma granulometria uniforme, passando a amostra através da malha de nylon com um diâmetro interior de 180 μm ± 7,6 μm.
    3. Colocar 2 g da matéria-prima moída (pesada com precisão) num balão de fundo redondo e adicionar 50 ml de clorofórmio à mesma.
    4. Ligue o balão a um condensador de refluxo e aqueça-o em banho-maria fervente (ebulição moderada) durante 60 minutos. Filtrar a solução de extracção com um papel de filtro de 15-20 μm.
    5. Evaporar o filtrado até perto da secura em banho-maria fervente (ebulição moderada) por cerca de 10 min.
    6. Dissolva o resíduo e compense o volume para 5 mL usando metanol. Finalmente, passe o sobrenadante através de uma membrana filtrante de 0,45 μm e coloque-o em modo de espera.
  3. Validação do método
    1. Tomar a solução-mãe de β-sitosterol preparada na subetapa 4.2.1, diluí-la com metanol a 100% e preparar soluções com concentrações de 100 μg/mL, 80 μg/mL, 60 μg/mL, 50 μg/mL, 40 μg/mL, 30 μg/mL e 20 μg/mL.
    2. Injetar as amostras sob as condições cromatográficas descritas na etapa 4.1 para determinar a área de pico, realizar análise de regressão com a área de pico para o volume de injeção e obter a equação de regressão e o coeficiente de correlação para avaliar sua linearidade.
    3. Preparar as amostras conforme descrito acima (etapa 4.2) e submetê-las à análise por HPLC (etapa 4.1) seis vezes no mesmo dia. Em seguida, calcule o RSD das áreas de pico para avaliar a precisão.
    4. Avaliar a estabilidade da solução da amostra analisando as mesmas soluções de amostra armazenadas no RT por 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h, conforme descrito na etapa 4.1. Em seguida, calcule a DSR das zonas de pico, tal como descrito no passo 1.3.5.
    5. Examinar a repetibilidade dissolvendo a mesma amostra (CMT-4) em sextuplicado, preparada conforme descrito no passo 4.2, e sujeitando-a à análise por HPLC, conforme descrito no passo 4.1. Em seguida, calcule o RSD do teor de β-sitosterol em seis amostras.
    6. Avalie a precisão do método empregando o método de adição padrão. Para isso, adicionar soluções de referência de β-sitosterol às amostras a 80%, 100% e 120% do teor de β-sitosterol e repetir cada condição três vezes, conforme descrito na etapa 4.1. Avalie a precisão do método calculando a recuperação média e o RSD.
      Observação : A fórmula de cálculo da taxa de recuperação (RR) é a seguinte:
      RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
      Onde M t = a qualidade do β-sitosterol após a adição do padrão, M 0 = a qualidade da solução da amostra e Ms = a qualidade do β-sitosterol adicionado.
  4. Determinação do teor de β-sitosterol das amostras
    1. Tomar 10 lotes de materiais medicinais chineses autênticos e cinco lotes de adulterantes relacionados para preparar soluções de amostra de acordo com a etapa 4.2.
    2. Em seguida, injectar cada solução de amostra e solução de referência de β-sitosterol para determinar a área de pico nas condições descritas no passo 4.1 e calcular o teor de β-sitosterol de cada amostra utilizando o método de um ponto padrão externo.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Impressão digital cromatográfica de Chuanmutong e análise de similaridade (SA)
Os valores de RSD do tempo relativo de retenção de precisão, repetibilidade e estabilidade foram inferiores a 0,46%, 1,65% e 0,53%, respectivamente; os valores de DSR da área de pico relativa foram inferiores a 4,23%, 3,56% e 3,96%, respectivamente. Como mostrado nas Figuras 1A,B, havia 12 picos comuns distintos (do pico 1 ao pico 12) nas impressões digitais de HPLC nas 10 amostras autênticas d...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A coleta de amostras para pesquisa é o primeiro passo fundamental para a construção do reconhecimento de vários padrões na identificação da autenticidade dos materiais medicinais chineses. Através de pesquisas de mercado, descobrimos que Sichuan Ya'an, Liangshan e Leshan são as principais áreas de produção de recursos selvagens de Chuanmutong. As variedades relacionadas do mesmo gênero também têm a mesma distribuição geográfica 6,20; CC, DC, DE, XS e SMT são freq...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Administração de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan (n.º 2020JC0088, n.º 2021MS203).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acéticoZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China2017381038
AcetonitrilaSigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Xangai, ChinaWXBD5243V
- SitosterolMeisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China20210201
  C18 colunaYuexu Material Technology Co., Ltd., Xangai, ChinaWelch Ultimate LP
ChuanmutongGuoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China 19020103CMT-1
ChuanmutongHongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 200701CMT-2
ChuanmutongHongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 200701CMT-3
ChuanmutongHongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 200901CMT-4
ChuanmutongXinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210701CMT-5
ChuanmutongHaobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210401CMT-6
ChuanmutongXinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 200901CMT-7
ChuanmutongWusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China 201201CMT-8
ChuanmutongLimin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China 201001CMT-9
ChuanmutongYuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China210501CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. WangMadzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China -CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils.Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China -DC
Clematis peterae Mão.-Mazz.Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China -DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et WilsMixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China -XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot.Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China -Balança eletrônica SMT
Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Xangai,  China FA1204
ErgosterolMeisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China20210201
EtanolKelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China2021112602
Acetato de etilaZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China2017042043
Ácido fórmicoKelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China2016062901
Cromatografia líquida de alta eficiênciaAgilent, EUA.1260
IBM SPSS Statistics versão 26.0International Business Machines Corporation, USA-Methanol
Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Xangai, ChinaWXBD6409V
MetanolKelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China202010302
álcool n-butílicoZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China2020071047
Éter de petróleoZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China2020090125
Ácido fosfóricoComeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China20200110
SESCF-TCM versão 2012Comissão Nacional da Farmacopeia,China-http://114.247.108.158:8888/login
StigmasterolMeisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China20210201
TriclorometanoSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Xangai, China20200214
versão Umetrics SIMCA 14.1.0.2047Umetrics, Suécia-https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-downloadde
água ultrapuraYoupu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, ChinaUPH-II-10T
Limpador ultrassônicoKunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, ChinaKH3200E
Máquina

Referências

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