Method Article

Análise de Amostras de Cyperi Rhizoma Cru e Processadas Usando Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas em Tandem em Ratos com Dismenorreia Primária

DOI:

10.3791/64691

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, uma análise comparativa de amostras de Cyperi rhizoma (CR) cruas e processadas é apresentada usando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência e espectrometria de massas em tandem de alta resolução (UPLC-MS/MS) em ratos com dismenorreia primária. As alterações nos níveis sanguíneos dos metabólitos e dos constituintes da amostra foram examinadas entre ratos tratados com CR e CR processados com vinagre (CRV).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyperi rhizoma (CR) é amplamente utilizado em ginecologia e é um medicamento geral para o tratamento de doenças das mulheres na China. Uma vez que o efeito analgésico da RC é aumentado após o processamento com vinagre, a RC processada com vinagre (CRV) é geralmente usada clinicamente. No entanto, o mecanismo pelo qual o efeito analgésico é aumentado pelo processamento do vinagre não está claro. Neste estudo, a técnica de cromatografia líquida de ultra-alta pressão acoplada à espectrometria de massas (UPLC-MS/MS) foi usada para examinar as alterações nos níveis sanguíneos dos constituintes exógenos e metabólitos entre ratos com dismenorreia tratados com RC e tratados com CRV. Os resultados revelaram diferentes níveis de 15 constituintes e dois metabólitos no sangue desses ratos. Entre eles, os níveis de (-)-mirtenol e ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético no grupo CRV foram consideravelmente maiores do que no grupo CR. O CRV reduziu o nível de prostanoides de 2 séries e leucotrienos de 4 séries com atividades pró-inflamatórias, de agregação plaquetária e vasoconstritoras e proporcionou efeitos analgésicos pela modulação do metabolismo do ácido araquidônico e do ácido linoleico e da biossíntese de ácidos graxos insaturados. Este estudo revelou que o processamento do vinagre aumenta o efeito analgésico da RC e contribui para o entendimento do mecanismo de ação do CRV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A dismenorreia primária (DP) é a condição mais prevalente na clínica ginecológica. Caracteriza-se por dor nas costas, inchaço, dor abdominal ou desconforto antes ou durante a menstruação, sem patologia pélvica no sistema reprodutivo1. Um relatório sobre sua prevalência mostrou que 85,7% dos estudantes sofrem de DP2. Os anticoncepcionais orais em baixas doses são a terapia padrão, mas seus efeitos adversos, como a trombose venosa profunda, têm chamado cada vez mais atenção3. A prevalência de trombose venosa profunda entre usuárias de anticoncepcional oral é de >1 por 1.000 mulheres, e o risco é maior nos primeiros 6-12 meses e em usuárias com mais de 40 anos4.

Muito utilizado na medicina tradicional chinesa (MTC), Cyperi rhizoma (CR) é derivado do rizoma seco de Cyperus rotundus L. da família Cyperaceae. A RC regula os distúrbios menstruais e alivia a depressão e a dor5. A RC é amplamente utilizada em ginecologia e é considerada um medicamento geral para o tratamento de doenças da mulher6. CR processado com vinagre (CRV) é normalmente usado clinicamente. Em comparação com a RC, a VRC mostra maior regulação da menstruação e alívio da dor. Estudos modernos têm demonstrado que a RC inibe a ciclooxigenase-2 (COX-2) e a subsequente síntese de prostaglandinas (PGs), alcançando assim um efeito anti-inflamatório. Enquanto isso, a RC apresenta efeito analgésico sem efeitos colaterais7, tornando a RC uma boa opção para pacientes com dismenorreia. No entanto, o mecanismo subjacente à regulação da menstruação e ao alívio da dor pelo CRV não está claro. A pesquisa em RC tem se concentrado principalmente em alterações em seus componentes químicos ativos e atividades farmacológicas, como seus efeitos anti-inflamatórios, antidepressivos e analgésicos 8,9,10,11,12.

Embora os ingredientes da MTC sejam complexos, eles são absorvidos pelo sangue e devem atingir uma concentração sanguínea específica para serem eficazes13. O escopo da triagem dos ingredientes ativos da MTC pode ser reduzido utilizando a estratégia de determinação de constituintes no sangue. A cegueira pode ser evitada no estudo dos componentes químicos in vitro, e a unilateralidade pode ser evitada no estudo dos constituintes individuais14. Ao comparar as composições de CR e CRV no sangue, alterações nos ingredientes ativos do CR processado podem ser detectadas de forma eficaz e rápida. A eficácia da droga é o processo pelo qual uma droga influencia o corpo. Alterações nos componentes da droga devido à resposta metabólica do organismo, que podem estar relacionadas ao mecanismo de ação da droga, podem ser determinadas com metabolômicos. Metabonomics visa medir as respostas metabólicas globais e dinâmicas, o que é consistente com a determinação da eficácia global da medicina tradicional chinesa15. Além disso, os metabólitos são o produto final da expressão gênica, que está mais intimamente relacionada aos fenótipos16. Assim, metabolômicas podem ser adequadas para explorar as diferenças nas vias metabólicas entre RC e CRV no tratamento da DP. A metabolômica não direcionada baseada em cromatografia líquida baseada em espectrometria de massas em tandem de alta resolução (LC-MS/MS) é caracterizada por alto rendimento, alta sensibilidade e alta resolução e pode ser usada para medir muitos componentes moleculares pequenos17,18 . Este método pode determinar simultaneamente os metabolitos endógenos e constituintes exógenos absorvidos no sangue. A metabinômica tem sido amplamente utilizada em estudos sobre MTC19, toxicologia de drogas 20, gestão em saúde 21, esportes22, alimentos 23 e outros campos.

Neste estudo, as diferenças nos constituintes exógenos absorvidos no sangue e nos metabólitos endógenos foram medidas entre ratos modelo de dismenorreia tratados com RC e tratados com CRV usando metabolômica não direcionada baseada em LC-MS/MS para revelar os mecanismos dos efeitos analgésicos do CRV.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos relacionados a animais foram conduzidos com aprovação do Comitê de Ética em Experimentos do Instituto Chongqing da MTC. Vinte e quatro ratas Sprague Dawley (SD) com 8-10 semanas de idade e pesando 200 g ± 20 g foram utilizadas neste experimento.

1. Preparação da extração

  1. Cálculo
    1. Planeie administrar o extracto de CR ou CRV a um grupo de tratamento de seis ratos Sprague-Dawley (10 g/[kg∙dia]) durante 3 dias. Use uma concentração de extrato CR ou CRV de 1 g/mL (1 mL do extrato é obtido a partir de 1 g de ervas).
      NOTA: A dosagem de CR é de 6-10 g. Neste estudo, a dose máxima de 10 g foi utilizada como dosagem. Como o peso médio de uma pessoa adulta é de 60 kg, a dose de adulto é de 0,1667 g/kg. De acordo com o algoritmo de conversão de peso24, como o coeficiente de conversão de dose entre humanos e ratos é de 6,3, a dosagem para ratos é de 1,05 g/kg. A dose da droga foi aumentada em 10 vezes para 10,5 g/kg para ratos. A dosagem foi fixada em 10 g/kg para a conveniência do cálculo e do experimento propriamente dito. Por exemplo, pelo cálculo, se for necessário um total de 36 g de CR ou CRV, o fitoterápico chinês deve ser preparado pelo menos duas vezes. Assim, foram necessários 200 g de RC - 100 g de RC foram usados como RC, e 100 g de RC foram processados em CRV.
    2. Calcular o volume de CR ou CRV a aplicar por rato utilizando a equação (1):
      V = 10 g/(kg∙dia) × 200 g/(1 g/mL) = 2 mL (1)
  2. Processamento do CRV
    1. Misturar 100 g de CR e 20 g de vinagre (>5,5 g de ácido acético/100 mL) e incubar por 12 h.
      NOTA: Para garantir que o interior do CR fosse umedecido por vinagre após 12 h, o CR e o vinagre foram misturados, bem agitados e, em seguida, agitados novamente até que a porção interna estivesse úmida.
    2. Frite a mistura em uma panela de ferro por 10 min a 110-120 °C. Em seguida, retire a mistura e deixe esfriar em temperatura ambiente.
      NOTA: Para evitar que o CR arda, é necessário mexer continuamente durante o aquecimento. Se o CRV processado estiver muito úmido, ele pode ser seco a 60 °C. Quando a superfície do CR é sépia, a fritura pode ser interrompida.
  3. Extração
    1. Extrato de CR
      1. Adicione 10 vezes (a quantidade de CR) água pura ao CR e deixe de molho por 2 h. Certifique-se de que os materiais medicinais estão abaixo do nível de líquido durante a imersão.
        NOTA: O CR só precisa ser cortado ao meio antes da extração. O objetivo da imersão é extrair os constituintes ativos de forma mais eficaz. O processo de imersão é essencial.
      2. Leve a mistura de água e remédio para ferver em fogo alto e mantenha fervendo em fogo baixo por 20 min. Filtrar com um pano filtrante (100 mesh) e recolher o filtrado.
        NOTA: Durante a decocção, um calor alto foi usado antes da fervura, e um fogo baixo foi usado para manter a ebulição.
      3. Repita o passo 1.3.1.2 uma vez e combine os filtrados.
      4. Concentrar o extracto com um evaporador rotativo a 1 g/ml (com base no medicamento original, a temperatura de concentração deve ser inferior a 60 °C).
        NOTA: Os componentes activos em CR são voláteis, pelo que a temperatura de concentração não deve ser superior a 60 °C.
    2. Extrato de CRV
      1. Execute as mesmas etapas (1.3.1.1-1.3.1.3) que para o método de extração CR.
    3. Extrato CR para teste
      1. Pipetar 500 μL do extrato CR e 500 μL de metanol para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e vórtice por 30 s para misturar.
        NOTA: Uma mistura de metanol e água extrai melhor os componentes ativos. O extrato não deve ser diretamente filtrado para teste.
      2. Centrifugar cada amostra durante 15 min a 1,6502 × g a 4 °C. Filtre o sobrenadante e, em seguida, transfira-o para o frasco para injetáveis de amostra para teste.
        NOTA: Após a centrifugação a alta velocidade da mistura de metanol e extracto, o sobrenadante pode ser transferido directamente para o frasco da amostra para determinação sem filtração. Devido ao calor gerado pelo processo de centrifugação, é preferível usar uma centrífuga criogênica.
    4. Extrato de CRV para teste
      1. Execute as etapas 1.3.3.1-1.3.3.2 para preparar o extrato de CRV para teste.

2. Animais

  1. Cálculo
    1. Tome 50 mg de benzoato de estradiol e adicione-o a 50 mL de azeite para preparar uma solução de 1 mg/mL. Tome 50 mg de ocitocina e adicione-a a 50 mL de soro fisiológico normal para preparar uma solução de 1 mg/mL.
      NOTA: A dose da injeção intraperitoneal de benzoato de estradiol e ocitocina é de 10 mg/(kg∙dia). O benzoato de estradiol é dissolvido no azeite de oliva, e a ocitocina é dissolvida em soro fisiológico. O benzoato de estradiol não é fácil de dissolver no azeite e pode ser tratado com ultrassom para acelerar a dissolução. Tanto o benzoato de estradiol quanto as soluções de ocitocina devem ser preparados diariamente.
    2. Calcular o volume de solução de benzoato de estradiol a aplicar por rato (ou seja, V = 10 mg/[kg∙dia] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Calcular o volume de solução de ocitocina a aplicar por rato (ou seja, V = 10 mg/[kg∙dia] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Agrupamento e administração de animais
    OBS: Foram atribuídos dez dias para administração25,26. Durante o tratamento, os ratos tiveram acesso irrestrito à ração padrão e à água. Dentro de 30 minutos após a administração de ocitocina, a atividade de contorção de cada rato foi rastreada. O modelo de PD foi desenvolvido com sucesso, como evidenciado pelas respostas de torção das ratas modelo, que incluíram contração uterina, rotação de um membro, extensão de membro posterior, tronco oco e contração abdominal26.
    1. Atribuir 24 ratos Sprague-Dawley fêmeas (ratos SD, 8-10 semanas de idade, pesando 200 g ± 20 g) em quatro grupos ao acaso - controle, modelo, CR e CRV - e alimentá-los por 7 dias.
    2. Administração de animais
      1. Injetar intraperitonealmente ratos nos grupos modelo, CR e CRV com 2 mL de solução de benzoato de estradiol todos os dias. Injetar intraperitonealmente nos ratos do grupo controle 2 mL de solução salina normal.
      2. A partir do dia 8, conclua a etapa 2.2.2.1. Em seguida, administrar por via intragástrica 2 mL de extrato de CRV aos ratos do grupo CRV, 2 mL de extrato de CR aos ratos do grupo RC e 2 mL de solução salina normal aos ratos dos grupos controle e modelo.
      3. No dia 10, conclua a etapa 2.2.2.2. Em seguida, injetar intraperitonealmente os ratos dos grupos modelo, RC e CRV com 2 mL de solução de ocitocina e os ratos do grupo controle com 2 mL de solução salina normal.
    3. Registrar os tempos de contorção dos ratos dentro de 30 min após a injeção de ocitocina.
  3. Coleta de amostras
    1. Coletar amostras de sangue da aorta abdominal, excisar o útero rápida e completamente, e separar cuidadosamente o tecido conjuntivo e a gordura aderida à parede uterina.
      NOTA: O sangue foi coletado dentro de dentro de 1 h após a dose final.
    2. Use tubos de microcentrífuga para preservar e transferir o tecido uterino para nitrogênio líquido. Conservar as amostras de tecido a -80 °C.
    3. Centrifugar as amostras de sangue durante 10 min a 4.125 × g. Retirar o sobrenadante que contém soro e centrifugar a 16.502 × g durante 10 minutos a 4 °C. Centrifugar o soro e, em seguida, mantê-lo no tubo a -80 °C para armazenamento.
      NOTA: As amostras de sangue devem ser deixadas à temperatura ambiente por 1 h para reprocessamento.
  4. Processamento de amostras
    1. Amostras de soro
      1. Coloque 400 μL de metanol e 200 μL de soro em um tubo de microcentrífuga e vórtice por 30 s para misturar. Centrifugar cada amostra durante 15 min a 16,502 × g a 4 °C. Encher frascos de amostra com o sobrenadante após a coleta e filtração. Misturar todos os sobrenadantes de cada amostra com o mesmo volume para preparar amostras de controle de qualidade para teste.
    2. Amostras de tecido uterino
      1. Tomar 100 mg de tecido uterino do segmento ipsilateral e triturá-lo com um volume nove vezes maior de soro fisiológico. Centrifugar o homogeneizado durante 10 min a 4.125 × g e recolher o sobrenadante. Colocar o sobrenadante num frigorífico a 4 °C para ensaio ou a -80 °C se não for ensaiado no mesmo dia.
      2. Coloque soro fisiológico, tecido e esferas de aço em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, coloque o tubo de microcentrífuga em nitrogênio líquido por 3-5 s e, em seguida, coloque o tecido em um moedor de tecido para moagem.
  5. Teste de amostra
    1. Use um ensaio imunoenzimático (ELISA) para medir o conteúdo de PGF2α e PGE2 nos tecidos uterinos das amostras de ratos.
      OBS: O kit ELISA PGE 2 para ratos foi utilizado para medir o conteúdo de PGE 2 e o kit ELISA PGF 2α para ratos foi utilizado para medir o nível de PGF2α. As etapas detalhadas podem ser encontradas nas instruções do fabricante. Os detalhes do kit são dados na Tabela de Materiais.
    2. Avaliar a amostra de soro, o extrato de CR e o extrato de CRV usando UPLC-MS/MS.
      1. Para UPLC, use uma coluna C18 (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) e um método de gradiente binário com fase móvel A contendo 0,1% de ácido fórmico e fase móvel B contendo acetonitrila. Defina o gradiente de eluição da seguinte forma: de 0 min a 1 min, 15% B; de 1 min a 8,5 min, 15% a 85% B; de 8,5 min a 11,5 min, 85% B; de 11,5 min a 11,6 min, 99% a 1% B; e de 11,6 min a 15 min, 15% B. Ajuste o fluxo para 0,35 mL/min e o volume de injeção para 2 μL.
      2. Para MS, ajuste a temperatura para 600 °C, a taxa de fluxo de gás de cortina (CUR) para 0,17 MPa, e as taxas de fluxo de bainha e gás auxiliar para 0,38 MPa. Ajuste a tensão de pulverização de íons do modo de íons positivos e do modo de íons negativos para 5,5 kV e −4,5 kV, respectivamente, a tensão de potencial de desagrupamento (DP) para 80 V ou −80 V, a energia de colisão (CE) para 40 eV ou −25 eV e a superposição de energia de colisão (CES) para 35 eV ± 15 eV.
      3. Execute o teste seguindo o protocolo do fabricante usando UPLC-MS/MS. Execute MS para uma faixa de massa de 50-1.000 m/z.
      4. Obtenha os resultados do UPLC-MS/MS usando o programa de estação de trabalho correspondente em conjunto com a aquisição dependente de informações do modo de detecção, o filtro de defeitos de massa múltipla e a dedução dinâmica de plano de fundo. Use as amostras de controle de qualidade do soro agrupado para testar a repetibilidade e estabilidade do equipamento UPLC-MS/MS para verificar a abordagem convencional. Antes das amostras de pesquisa, injetar as amostras de controle de qualidade por quatro tiragens sucessivas e, em seguida, injetá-las após cada cinco amostras de soro.

3. Processamento de dados

  1. Preparação dos dados
    1. Use o software de conversão para converter os dados brutos para o formato mzXML. Normalize os dados de corrente iônica total (TIC) de cada amostra.
      NOTA: Uma aplicação interna baseada em R (www.lims2.com) construída em XCMS foi usada para analisar as informações para a integração, alinhamento, extração e detecção de pico27.
    2. Execute a anotação de metabólitos usando um banco de dados MS2 proprietário (www.lims2.com). Defina o limite de anotação para 0,328.
      OBS: Os metabólitos endógenos foram identificados em cada grupo.
  2. Análise de componentes principais e análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais
    1. Utilize softwares de análise para realizar a análise de componentes principais (ACP) e a modelagem. Importar os dados padronizados dos metabólitos para o software de análise. Em seguida, use o ajuste automático para criar o modelo de análise. Por fim, utilizar o escore para obter o gráfico de dispersão do escore da ACP.
      OBS: O agrupamento de cada grupo foi obtido com o gráfico de dispersão dos escores da ACP. A ACP é uma modalidade de análise não supervisionada que agrupa principalmente as amostras por meio de redução de dimensões sem intervenção.
    2. Utilizar o software de análise para realizar a análise discriminante ortogonal de mínimos quadrados parciais (OPLS-DA).
      1. Importar os dados padronizados dos metabólitos nos grupos CR e CRV para o software de análise.
      2. Importe os dados do grupo CR para o grupo CR criado e importe os dados do grupo CRV para o grupo CRV criado.
        NOTA: OPLS-DA é um modo de análise supervisionado, sendo necessário o agrupamento das amostras.
      3. Em seguida, use o ajuste automático para construir o modelo de análise e use a pontuação para obter o gráfico de dispersão de pontuação do OPLS-DA. Por fim, utilizar o VIP para obter a variável significância no valor da projeção (VIP) no OPLS-DA.
        OBS: A significância das variáveis nos valores de projeção (VIP) dos metabólitos nos grupos RC e CRV foi obtida através do OPLS-DA.
  3. Identificação dos potenciais metabólitos diferenciais
    1. Seleccione os metabolitos com valores VIP superiores a 1 no passo 3.2.2.3.
    2. Utilizar software estatístico para calcular o valor de P dos metabólitos que foram selecionados na etapa 3.3.1 pelo teste t de Student.
      NOTA: Diferenças significativas nos potenciais metabólitos diferenciais nos grupos RC e CRV foram determinadas pelo teste t de Student. Os potenciais metabólitos diferenciais foram aqueles com valor de p do teste t de Student < 0,05 e significância da variável na projeção (VIP) maior que 1. A representação foi realizada usando uma parcela vulcânica.
  4. Identificação dos metabólitos diferenciais
    1. Seleccione os potenciais metabolitos diferenciais no passo 3.3. Utilize os resultados do passo 3.1.2 para identificar estes metabolitos diferenciais.
      NOTA: Um pequeno número de potenciais metabólitos diferenciais foram identificados, e eles se tornaram os metabólitos diferenciais candidatos.
    2. Filtre os metabólitos diferenciais a serem correspondidos no banco de dados KEGG. Mostrar as mudanças nos metabólitos diferenciais nos grupos CR e CRV desenhando um mapa de calor.
      NOTA: Um pequeno número de metabólitos diferenciais candidatos foram combinados, e eles se tornaram os metabólitos diferenciais.
  5. Exame das vias metabólicas potenciais
    1. Carregue os diferentes metabólitos no banco de dados Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Use a Análise de Vias para obter as vias metabólicas potenciais.
      LEGENDA: As potenciais vias metabólicas foram obtidas nos grupos RC e CRV. O valor de P e o valor de impacto foram dois indicadores muito importantes na seleção das vias críticas. O valor de P foi mais importante do que o valor de impacto. A significância foi definida pelo valor de P < 0,05; Maiores valores de impacto foram associados a melhores correlações.
    3. Analise as vias metabólicas potenciais carregando os diferentes metabólitos para o banco de dados KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      NOTA: A relação entre a função da via metabólica e a DP também deve ser considerada. As vias metabólicas críticas foram obtidas.
  6. Identificação dos constituintes absorvidos no sangue
    1. Identifique os constituintes químicos nos extratos de CR e CRV usando o banco de dados interno MS2 (www.lims2.com), o banco de dados de metaboloma humano (HMDB) e os bancos de dados Massbank e Chemspider.
    2. Determinar os constituintes absorvidos no sangue nos grupos CR e CRV e comparar os constituintes entre os grupos CR e CRV.
      NOTA: Os constituintes absorvidos no sangue devem ser detectados nos grupos CR ou CRV, mas não podem ser detectados no grupo controle.
  7. Análise estatística
    1. Analisar os dados por meio de análise univariada (UVA) e métodos estatísticos multivariados, incluindo a análise de variância (ANOVA) e o teste t de Student.
      OBS: As informações experimentais foram apresentadas por meio de software estatístico como média ± desvio padrão (±DP). P < 0,01 foi considerado uma diferença altamente significativa, e P < 0,05 representou uma diferença significativa28.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Análise do experimento do modelo de dismenorreia
Não houve resposta de contorção dentro de 30 minutos no grupo controle porque esses ratos não foram injetados intraperitonealmente com ocitocina e benzoato de estradiol para causar dor. Os ratos dos grupos modelo, RC e CRV apresentaram reações de contorção substanciais após a injeção de ocitocina. Esses resultados demonstram a eficácia da combinação de benzoato de estradiol e ocitocina na indução de dismenorreia. As diferenças nos níveis de PGF 2α, PGE ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Devido à grande variedade e natureza diferente dos MTCs, essas ervas às vezes não funcionam na prática clínica, e isso pode ser devido ao processamento inadequado e decocting de MTCs. Os mecanismos da MTC estão se tornando mais evidentes com o uso da ciência e tecnologia contemporâneas29,30. Este estudo mostra que tanto a RC quanto a CRV têm efeitos terapêuticos em ratos modelo de DP e que o efeito terapêutico da CRV é mais substancial. O mecanismo de ação do CRV...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Comissão Municipal de Saúde e Planejamento Familiar de Chongqing Projeto de Ciência e Tecnologia de Medicina Chinesa (Número do Projeto: ZY201802297), Projeto Geral da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (Número do Projeto: cstc2019jcyj-msxmX065), Chongqing Modern Mountain Area Characteristic High-efficiency Agricultural Technology System Innovation Team Building Plan 2022 [10] e Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Processamento Médico.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrila Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20Beckman  Coulter, Inc.
benzoato de estradiolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdC10042616
ácido fórmicoFisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA177799
sistema LC 30AShimadzu, Kyoto, Japão228-45162-46
AzeiteShanghai Yuanye Biotechnology Co., LtdH25A11P111909
Ocitocina sintéticaZhejiang peptide biology Co., Ltd 
Rato PGF2α Kit ELISAShanghai lmai Bioengineering Co., Ltd202101
Rato PGFE2 Kit ELISAShanghai lmai Bioengineering Co., LtdEDL202006217
SPF Ratos Sprague-DawleyHunan SJA Laboratory Animal Co., LtdNúmero do certificado SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Áustria1510002987
sistema triplo TOF 4600SCIEX, Framingham, MA, EUABK20641402
águaFisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA152720
MRZ15K0472019092001

References

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