Ensaio verde de malaquita para a descoberta de inibidores da proteína de choque térmico 90

Resumo

O protocolo de ensaio verde de malaquita é um método simples e econômico para descobrir supressores de proteína de choque térmico 90 (Hsp90), bem como outros compostos inibidores contra enzimas dependentes de ATP.

Resumo

A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é um alvo anticâncer promissor devido ao seu efeito de chaperoning sobre múltiplas proteínas oncogênicas. A atividade da Hsp90 é dependente de sua capacidade de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP) em adenosina difosfato (ADP) e fosfato livre. A atividade ATPase da Hsp90 está ligada à sua função de chaperoning; ATP liga-se ao domínio N-terminal do Hsp90, e interromper sua ligação foi encontrado para ser a estratégia mais bem sucedida na supressão da função Hsp90. A atividade da ATPase pode ser medida por um ensaio colorimétrico verde de malaquita, que determina a quantidade de fosfato livre formado pela hidrólise de ATP. Aqui, um procedimento para determinar a atividade ATPase da levedura Hsp90 usando o kit de ensaio de fosfato verde de malaquita é descrito. Além disso, instruções detalhadas para a descoberta de inibidores de Hsp90 tomando geldanamicina como um inibidor autêntico é fornecida. Finalmente, a aplicação deste protocolo de ensaio através da triagem de alto rendimento (HTS) de moléculas inibidoras contra a levedura Hsp90 é discutida.

Introdução

A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma chaperona molecular que mantém a estabilidade de proteínas responsáveis pelo desenvolvimento e progressão do câncer. Além disso, proteínas responsáveis pelo desenvolvimento de resistência a agentes antineoplásicos também são clientes da Hsp90¹. A Hsp90 é superexpressa de forma ubíqua em todos os tipos de células cancerosas (>90% das proteínas celulares), em comparação com as células normais, onde pode constituir menos de 2% das proteínas totais. Além disso, a Hsp90 das células cancerosas reside em um complexo com cochaperonas, enquanto em uma célula normal está presente predominantemente em um estad....

Protocolo

1. Ensaio verde de malaquita em escala de laboratório

1. Preparação do tampão de ensaio
   1. Preparar o tampão de ensaio, de acordo com a composição e preparação apresentadas na Tabela 1.
2. Preparação de padrões de fosfato
   1. Utilizar o padrão de fosfato de 1 mM, fornecido no kit de ensaio de fosfato verde de malaquita (armazenado a 4 °C).
   2. Pipetar 40 μL de fosfato padrão 1 mM em 960 μL de água ultrapura para obter 40 μM de solução de fosfato (solução de pré-mistura). Adicionar a solução de pré-mistura com água ultrapura, de acordo com as instruções do fabricante, para formar uma diluição em ....

Resultados

Os resultados do ensaio são interpretados em termos de absorbância devido à concentração livre do íon fosfato. A absorbância por fosfato livre devido à hidrólise de ATP pela levedura Hsp90 a 620 nm é considerada como 100% de atividade da ATPase, ou zero porcentagem de inibição proteica. A inibição da proteína leva à cessação da hidrólise de ATP (menos fosfato livre). o que se reflete em termos de diminuição da absorbância a 620 nm.

Resultados do ensaio verde de malaquita em escala labo.......

Discussão

Hsp90 é um alvo significativo para a descoberta de novas moléculas de drogas anticancerígenas. Desde que sua farmacogabilidade foi estabelecida em 1994^{10, 18} moléculas chegaram a ser experimentadas clinicamente. Atualmente, sete moléculas estão em várias fases de ensaios clínicos, isoladamente ou em combinação²². Todas essas pequenas moléculas são inibidores de ligação do ATP N-terminal. Os outros meios de inibir a chaperona (inibidores C-terminais, inibidores do domínio mé.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de cloreto de magnésio 1M em água	Sigma-Aldrich	63069-100ml
Solução de cloreto de potássio 1M em água	Sigma-Aldrich	60142-100ml
	SPL Life Sciences	Não aplicável
Adenosina 5′-trifosfato sal dissódico hidrato	Sigma-Aldrich	A7699-5G
Biomek FX laboratório estação de trabalho de automação	Beckman Coulter	Não aplicável
Compostos 3-96	Não aplicável	Não aplicável	levedura Hsp90 marcada com histidina foi obtida do Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, Reino Unido, e a proteína foi expressa no KIST Gangneung Institute of Natural Products. Os detalhes não podem ser divulgados devido a problemas de violação de patente.
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D8418
Geldanamicina, 99% (HPLC), pó	AK Scientific, Inc.	V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Água Destilada	ThermoFisher Scientific	10977015
Malaquita Green Phosphate Assay  Kit de ensaio	Sigma-Aldrich	MAK307-1KT
Leitor de microplacas multidetecção Synergy HT	Biotek Instruments, Inc.	Não aplicável
Leitor multiplacas Synergy HT	Biotek Instruments, Inc.	Não aplicável
tampão de cloridrato de Trizma, pH7.4	Sigma-Aldrich	93313-1L
Levedura Hsp90	Não aplicável	Não aplicável Escola	de Ciências da Vida, Universidade de Sussex, Reino Unido e a proteína foi expressa no KIST Gangneung Institute of Natural Products. Número de acesso primário: P02829

Placa de 96 poços A Solução