Construção, caracterização e aplicação regenerativa de agregados de células-tronco mesenquimais humanas automontadas

Resumo

Este estudo descreve um método para construir agregados baseado na automontagem de células-tronco mesenquimais humanas e identifica as características morfológicas e histológicas para o tratamento regenerativo de defeitos ósseos cranianos.

Resumo

As células-tronco mesenquimais (CTMs), caracterizadas por sua capacidade de autorrenovação e potencial de diferenciação de múltiplas linhagens, podem ser derivadas de várias fontes e estão emergindo como candidatas promissoras para a medicina regenerativa, especialmente para a regeneração do dente, osso, cartilagem e pele. A abordagem auto-montada de agregação de MSC, que constrói notavelmente aglomerados de células imitando a condensação mesenquimal em desenvolvimento, permite a entrega de células-tronco de alta densidade junto com interações célula-célula preservadas e matriz extracelular (ECM) como nicho de microambiente. Este método demonstrou permitir o enxerto e a sobrevivência de células eficientes, promovendo assim a aplicação otimizada de MSCs exógenas na engenharia de tecidos e protegendo a regeneração clínica de órgãos. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a construção e caracterização de agregados auto-montados com base em células-tronco mesenquimais do cordão umbilical (UCMSCs), bem como um exemplo da aplicação regenerativa do osso craniano. A implementação deste procedimento ajudará a orientar o estabelecimento de uma estratégia eficiente de transplante de MSC para engenharia de tecidos e medicina regenerativa.

Introdução

A condensação de células-tronco mesenquimais (CTM) é uma etapa essencial para garantir o crescimento e desenvolvimento normal do corpo no início da organogênese ^1,2, especialmente na formação de ossos, cartilagens, dentes e pele ^1,3,4. Nas últimas décadas, as terapias de engenharia de tecidos usando MSCs pós-natais cultivadas combinadas com scaffolds biodegradáveis fizeram avanços importantes na regeneração osteogênica⁵ e cartilaginosa⁶.....

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Quarta Universidade Médica Militar e realizados de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. UCMSCs humanos criopreservados que foram obtidos de uma fonte comercial foram usados para o presente estudo (ver Tabela de Materiais). O uso de células humanas foi aprovado pelo Comitê de Ética da Quarta Universidade Médica Militar. As UCMSCs foram tomadas como exemplo para descrever o procedimento. O defeito craniano foi tomado como exemplo para mostrar a necessidade de ....

Resultados

Os agregados podem ser construídos com sucesso a partir de UCMSCs de acordo com o fluxo de trabalho experimental (Figura 1). A qualidade dos agregados deve ser avaliada antes do uso, por meio de observação morfológica e análise histológica. A estrutura lamelar formada deve ser completa e densa, com as células entrelaçadas para formar um padrão tecido por observação microscópica (Figura 2A). A ondulação da borda pode ser descoberta durante a agregação; b.......

Discussão

Com os avanços da biotecnologia de engenharia de tecidos, as estratégias para construir uma estrutura implantável com alta plasticidade e contendo células sobreviventes a longo prazo que possam alcançar a regeneração ideal têm sido o foco de muitos cientistas. Há uma variedade de métodos atuais de implantação de CTMs, como métodos somente celulares, scaffolds complementados com citocinas ^6,24 ou a combinação de células-tronco e s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	Sigma	T4049
Máquina de desidratação automática	LEICA	ASP200s	Centrífuga de agregados desidratados
Eppendorf	5418R
centrífuga	Thermo Nunc	339650	centrifugação
	Thermo	150466	Cultura de UCMSCs
Etanol	SCR	10009218	Desidratar agregado
Soro bovino fatal	Sijiqing	11011-8611	Cultura de UCMSCs
Fórceps	JZ	JD1080	Colheita agregado
Glutaraldeído	Proandy	10217-1	Fixação de
agregado Hematoxilina e Eosina Kit de coloração	beyotime	C0105S	HE coloração
Hexametildisilazane	SCR	80068416	Superfície agregada seca
Hoechst33342	Sigma	14533	Núcleo celular mancha
L-glutamina	Sigma	G5792	Cultura de UCMSCs
Kit de Viabilidade/Citotoxicidade Vivo/Morto	Invitrogen	L3224	Coloração de células vivas/mortas
Kit de coloração de Masson	ZHC	CD069	Coloração
Masson Mínimo Essencial Médio Alfa básico (1x)	Gibco	C12571500BT	Cultura de UCMSCs
Parafina	Leica	39601006	Incorporação de tecido
Paraformaldeído	Saint-Bio	D16013	Fixação de agregado
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Ressuspender e purificar UCMSCs
Penicilina / Estreptomicina	Procell Life Science	PB180120	Cultura de UCMSCs
Pentobarbital sódico	Sigma	P3761	Anestesia animal
Polisporina	Pfizer		Prevenir o olho seco
Microscópio eletrônico de varredura	Hitachi	s-4800	Observação SEM
Tesoura	JZ	Y00030	Incisão cirúrgica animal
Placa de seis poços	Thermo	140675	Cultura de UCMSCs
Stitch	Jinhuan	F603	Fechar feridas
Sutura	Xy	4-0	Fechar feridas
Equipamento termostático	Grant	v-0001-0005	Banho-maria
UCMSCs	Bai'ao& nbsp;	UKK220201	Comercialmente UCMSCs
o SCR do Xileno	10023418		Agregado desidratado

de passagem de célula Tubo de de centrifugação Placa de cultura de Agregado de Vitamina C Diyibio DY40138-25g que induz