Ensaio de Sedimentação à Base de Concanavalina A para Medir a Ligação ao Substrato de Fosfatases Glucanas

Resumo

Este método descreve um ensaio de sedimentação in vitro baseado em lectina para quantificar a afinidade de ligação da fosfatase glucana e amilopectina. Este ensaio de co-sedimentação é confiável para medir a ligação do substrato glucana fosfatase e pode ser aplicado a vários substratos glucanos solubilizados.

Resumo

As fosfatases glucanas pertencem à maior família de fosfatases de dupla especificidade (DSP) que desfosforilam substratos glucanos, como glicogênio em animais e amido em plantas. As estruturas cristalinas da fosfatase glucana com substratos modelo de glucana revelam distintas interfaces de ligação glucanas feitas de DSP e domínios de ligação a carboidratos. No entanto, medidas quantitativas das interações glucano-glucana fosfatase com substratos fisiologicamente relevantes são fundamentais para o entendimento biológico da família de enzimas glucanas fosfatases e para a regulação do metabolismo energético. Este manuscrito relata um ensaio de sedimentação in vitro baseado em Concanavalina A () projetado para detectar a afinidade de ligação ao substrato das fosfatases glucanas contra diferentes substratos glucanos. Como prova de conceito, determinou-se a constante de dissociação (K_D) da fosfatase de glucana Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) e amilopectina. A caracterização dos mutantes SEX4 e de outros membros da família de enzimas glucanas fosfatases demonstra ainda mais a utilidade deste ensaio para avaliar a ligação diferencial das interações proteína-carboidrato. Estes dados demonstram a adequação deste ensaio para caracterizar uma ampla gama de proteínas interagindo amido e glicogênio.

Introdução

As fosfatases glucanas são membros de uma subfamília funcionalmente diversa de fosfatases de dupla especificidade (DSPs) dentro da^{superfamília 1} da proteína tirosina fosfatase (PTP). Eles têm sido encontrados na maioria das formas de vida, incluindo organismos fotossintéticos amplamente divergentes, humanos, vertebrados e alguns invertebrados e protistas ^2,3,4. As plantas contêm três fosfatases glucanas conhecidas: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) e Like Sex Four2 (LSF2)^5,6,7

Protocolo

1. Preparação de contas de-Sepharose

1. Completar 250 mL de um tampão de ligação contendo 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 e 0,2 mM CaCl₂. Ajustar o pH utilizando solução de NaOH 1 M.
2. Pipetar 250 μL de suspensão de esferas de-Sepharose para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar o conteúdo a 10.000 x g durante 30 s a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
   NOTA: 250 μL de esferas de-Sepharose em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL são necessários para cada concentração de amilopectina usada para o ensaio.
3. Adicionar 750 μL do tampão de ligação a cada tubo contendo 250 μL de esferas de-S....

Resultados

Uma das principais características da família de proteínas glucanas fosfatases é a sua capacidade de se ligar a substratos glucanos. Primeiramente, a capacidade de ligação do SEX4 às esferas de-Sepharose:amilopectina foi analisada usando SDS-PAGE (Figura 2A). A albumina de soro bovino (BSA) serviu como controle negativo para detectar qualquer ligação inespecífica de proteínas às esferas de-Sepharose:amilopectina. A análise das proteínas em SDS-PAGE mostrou a presença da proteína SEX4 na fraç.......

Discussão

Este estudo demonstra o desenvolvimento bem-sucedido de um novo ensaio de sedimentação in vitro que permite determinar a afinidade de ligação das interações glucano-glucana fosfatase. O projeto do ensaio aproveita a ligação específica da lectina aos glucanos através dos resíduos hidroxila de glicose para capturar indiretamente substratos de carboidratos solubilizados em esferas de Sepharose. Isso permite a separação de frações proteicas ligadas e não ligadas via centrifugação e determinação da .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
O anticorpo monoclonal 6x-His Tag (HIS. H8), HRP	Therm Fisher Scientific	MA1-21315-HRP
Biorad gel electroforese e kit Western blot	Biorad
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	208291
scanner de manchas C-Digit	LICOR	3600-00	Scanner
de manchas Coquetel completo de inibidores de protease	Sigma-Aldrich	11836170001
Concanavalina Grânulos de sepharose	Sigma-Aldrich	C9017	Este produto contém  em tampão acetato 0,1 M, pH 6, contendo 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 e 1 mM MgCl2 em etanol a 20%
Centrífuga	Eppendorf	5425R
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	de análise de dados	versão 8.0
HEPES	Sigma-Aldrich	H8651
Image Studio	LICOR	3600-501	Software de aquisição
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M2670
Metanol	Fisher Scientific	A452SK-4
Dodecil sulfato de sódio	Fisher Scientific	PI28312
Amilopectina de batata	Sigma-Aldrich	A8515
Géis SDSPAGE Pré-moldados	Genscript	M00653S
Base Tris	Fisher Scientific	BP154-1
Tween 20	Fisher Scientific	MP1TWEEN201
Westernsure substrato de quimioluminescência premium	LI-COR	926-95000