Acompanhando a Dinâmica de Variantes Estruturais em Populações Experimentalmente Evoluídas

Summary

Desenvolvemos um método custo-efetivo para acompanhar a dinâmica alélica de polimorfismo de nucleotídeo não único que pode ser facilmente adaptado à evolução experimental de arquivos congelados. Uma técnica de triplet PCR foi acoplada à eletroforese capilar paralela automatizada para quantificar a frequência relativa de um alelo de inserção ao longo da evolução experimental.

Abstract

Sabe-se agora que as variantes estruturais (SVs) (ou seja, deleções, inserções, duplicações e inversões) desempenham um papel importante na variação fenotípica e, consequentemente, em processos como determinação de doenças ou adaptação a um novo ambiente. No entanto, as variantes de nucleotídeo único recebem muito mais atenção do que as SVs, provavelmente porque são mais fáceis de detectar e seus efeitos fenotípicos são mais fáceis de prever. O desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento profundo de leitura curta e longa melhorou fortemente a detecção de SVs, mas a quantificação de sua frequência a partir de dados de sequenciamento agrupado (poolseq) ainda é tecnicamente complexa e cara.

Aqui, apresentamos um método bastante simples e de baixo custo, que permite aos pesquisadores acompanhar a dinâmica da frequência alélica do VS. Como exemplo de aplicação, seguimos a frequência de inserção de uma sequência de inserção (SI) em populações de evolução experimental de bactérias. Este método é baseado no planejamento de trigêmeos de primers ao redor das bordas variantes estruturais, de modo que os amplicons produzidos pela amplificação do wild-type (WT) e alelos derivados diferem em tamanho em pelo menos 5%, e que sua eficiência de amplificação é semelhante. A quantidade de cada amplicon é então determinada por eletroforese capilar paralela e normalizada para uma curva de calibração. Este método pode ser facilmente estendido para a quantificação da frequência de outras variantes estruturais (deleções, duplicações e inversões) e para abordagens pool-seq de populações naturais, incluindo populações de patógenos intra-pacientes.

Introduction

Variantes estruturais (SVs) são alterações da sequência genômica, geralmente afetando 50 pb ou mais. As quatro categorias de SVs descritas são grandes inserções, grandes deleções, inversões e duplicações. Até recentemente, mais atenção tem sido dedicada às variantes de nucleotídeo único (SNVs) do que às variantes estruturais, em termos de seus efeitos fenotípicos e seu papel como determinantes genéticos da doença, ou sua contribuição para a adaptação. Isso provavelmente ocorre porque é mais fácil detectar SNVs e prever seus efeitos fenotípicos. No entanto, tecnologias de sequenciamento profundo de leitura curta e longa têm melhorado fortemente a detecção de SVs, pelo menos em genomas individuais ou clonais¹. Paralelamente, seus efeitos fenotípicos têm sido melhor caracterizados, e muitos exemplos de sua implicação como determinantes genéticos de doenças humanas ^2,3 ou adaptação a um novo ambiente⁴ têm sido documentados.

Deleções e inserções, muitas vezes devido a inserções de elementos genéticos móveis (MGE), são muito mais disruptivas do que polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e levam a mutações frameshift e modificações na estrutura de proteínas. Deleções e inserções de MGE dentro de genes quase sempre resultam em inativação gênica, e inserções em regiões não codificantes podem levar à repressão ou expressão constitutiva de genes adjacentes quando sequências de inserção (ISs) contêm^sequências promotoras ou terminativas5. Enquanto o nocaute de genes essenciais leva a efeitos prejudiciais claros sobre a aptidão bacteriana, a perda de genes não essenciais é benéfica em alguns casos. Apesar de seus custos inerentes, as duplicações também podem ser vantajosas e participar da adaptação, pois levam a uma mudança na dosagem gênica; Um aumento na atividade de uma proteína específica pode ser vantajoso dependendo das condições⁶.

Populações de evolução microbiana experimental são geralmente iniciadas com clones. Esta ausência inicial de diversidade genética, combinada com o "ambiente fechado" característico dos tubos de ensaio, leva a um potencial muito limitado de evolução por ganho gênico através da transferência horizontal de genes e recombinação. Nessas condições específicas, a contribuição para a adaptação de deleções, duplicações e inserção intragenômica de MGE é particularmente importante; as bactérias frequentemente se adaptam através de mutações de perda de função (principalmente devido a deleções ou inserções de MGE), afetando genes que não são úteis em ambientes artificiais estáveis, muitas vezes ricos em nutrientes, de monocultura⁷. No mais longo experimento de evolução de E. coli , as inserções de IS150 são particularmente frequentes entre populações evoluídas após 50.000 gerações, com elementos de SI representando 35% das mutações que atingem alta frequência em populações que mantêm sua taxa de mutação de ponto ancestral⁸.

Estudos de evolução e reseqüenciamento acoplam evolução experimental e tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) para investigar como as bactérias se adaptam, em nível fenotípico e genômico, a diferentes condições e estresses ambientais, como diferentes fontes de carbono e energia, antibióticos^{e estresse} osmótico9,10,11 . Esses estudos tipicamente obtêm informações genômicas sobre as populações ou clones evoluídos apenas no desfecho experimental e, em alguns casos, em vários momentos intermediários^12,13,14. Esses dados fornecem informações sobre genes e caminhos envolvidos na adaptação a um determinado ambiente, mas raramente permitem que os pesquisadores acompanhem a dinâmica de alelos emergentes e abrangentes ao longo do tempo.

Uma abordagem para seguir essas dinâmicas é escolher um número limitado de alelos segregantes de interesse (por causa da função dos genes que eles afetam, porque eles varrem em paralelo em populações independentes, etc.) e usar o sequenciamento de amplicon para quantificar a proporção alélica, agrupando muitos pontos de tempo na mesma sequenciamento¹⁵. Este método tem sido usado com sucesso para acompanhar a dinâmica de variantes de tamanho pequeno (SNPs ou indels de 1 pb) em populações experimentais de¹⁶ e¹⁷ micróbios naturais. No entanto, no caso de indels maiores ou inserções de MGE, a diferença de tamanho dos amplicons induz diferenças de eficiência de PCR, que distorcem a relação entre as proporções de leitura e alelo. Em certos casos, a diferença de tamanho entre os dois alelos é superior ao comprimento clássico do amplicon. Aqui, acoplamos uma técnica de PCR triplete com eletroforese capilar paralela automatizada para quantificar a frequência relativa de um alelo de inserção com base na discriminação de tamanho. Esta abordagem permite a exploração de pontos de tempo experimentais subutilizados para determinar a dinâmica de um alelo mutante emergente e acompanhar sua frequência de fixação ou perda, de maneira custo-efetiva. Nós aplicamos este método para rastrear alelos mutS^- emergentes, mutados através de uma inserção IS10, fornecendo ao genótipo mutado um fenótipo hipermutador.

Este método requer dois alelos-alvo com uma diferença de ≥5% no tamanho. Primeiro, os trigêmeos de primer são projetados para produzir fragmentos de tamanho semelhante, que compartilham um primer comum. Em segundo lugar, as condições de PCR são otimizadas, e uma curva de calibração é produzida usando misturas de gDNA selvagem (WT) e mutante. Finalmente, as amostras são amplificadas por PCR, e a frequência relativa de cada alelo é quantificada por eletroforese capilar quantitativa paralela.

Protocol

A configuração deste protocolo requer conhecimento preciso do ponto de inserção, exclusão, inversão ou duplicação dentro da sequência ancestral. Essas informações são geralmente obtidas por sequenciamento do genoma completo (WGS) das amostras de ponto final ou intermediário. No protocolo a seguir, o princípio geral para o caso de uma mutação de inserção é dado para cada etapa, juntamente com um caso representativo em que a frequência de uma inserção de IS10 no gene mutS em uma população de evolução experimental de E. coli é seguida. Nessa população, o WGS da população endpoint identificou a inserção de um IS10 de 1.329 pb entre as posições 2.463 e 2.471, resultando na duplicação desse sítio de inserção. Esse método é aplicável aos outros três tipos de VS, e as especificidades de cada caso são apresentadas na discussão.

1. Projeto de primers tripletes

1. Use práticas clássicas de design de primers (18-24 pb, 40%-60% de conteúdo GC, início/fim com pares G/C sempre que possível, diferença de T_m < 5 °C) para produzir primers FW1 e RV1. Projete primers para amplificar um amplicon curto no alelo WT ao redor do sítio de inserção do alelo mutante (Figura 1).
   NOTA: O tamanho do amplicon pode variar de 100 pb a até 3.000 pb, de acordo com a escada de tamanho do DNA usada na eletroforese capilar. Neste exemplo, um amplicon de 155 pb foi amplificado. O pequeno tamanho do fragmento escolhido aqui impede a amplificação fora do alvo de toda a sequência de inserção IS10 (ver secção 2).
2. Projete um segundo primer forward FW2 dentro da sequência de inserção, para produzir um segundo amplicon que seja aproximadamente 5% maior ou menor que o amplicon WT (Figura 1). Essa diferença de tamanho de 5% é a diferença de tamanho mínima que o dispositivo de eletroforese capilar paralela poderia distinguir de forma confiável. Portanto, projete os primers de forma que os dois amplicons tenham uma diferença de tamanho, que está acima, mas o mais próximo possível do limiar relativo.
   NOTA: Certifique-se de minimizar a diferença de T_m e a formação de dímeros de primer. Neste exemplo, um segundo primer para frente foi projetado para produzir um amplicon de 226 pb, 71 pb maior que o amplicon WT. Neste exemplo representativo, as sequências de primers são as seguintes:
   FW1: AAAGCATTTCGCCGAACGCC
   RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC
   FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG

Figura 1: Esquema do desenho do primer triplete no gene mutS WT e inserção do mutante mutS IS10. O triângulo preto representa o sítio de inserção do IS10 no gene mutS. O gene WT está em azul e o IS10 está em laranja. Os primers FW1 e RV1 sinalizam o sítio de inserção do IS10 e produzem um amplicon WT de 155 pb. O primer RV1 e o primer intra-IS10 FW2 produzem um segundo amplicon de 226 pb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Otimização das condições de PCR

1. Cultivar uma cultura noturna de clones de alelos mutantes e WT fixos.
2. Extraia o DNA usando qualquer kit.
3. Quantificar o DNA.
4. Preparar a amostra de DNA diluindo a extração de WT e DNA mutante para 5 ng/μL. Misture as duas amostras de DNA em uma proporção de 50/50.
5. Amplificar 10 ng das três amostras de DNA (WT, mutante, mistura 50/50) usando uma mistura mestre de PCR 2x pronta para uso, 0,5 μM FW1 primer, 1 μM RV1 primer e 0,5 μM FW2 primer em um volume de reação de 20 μL. Use um gel de agarose a 2% para migrar o produto da PCR por eletroforese clássica e determinar as condições ótimas de PCR.
   NOTA: Os tempos de alongamento devem ser minimizados para evitar a formação dos amplicon de FW1 e RV1 no alelo mutante. A temperatura de anelamento deve ser ajustada para minimizar a amplificação enviesada dos alelos e a amplificação inespecífica.
   1. Para seguir o programa neste exemplo, use as seguintes configurações: 98 °C por 10 s, seguido por 25 ciclos de 98 °C por 1 s, 58 °C por 15 s, 72 °C por 8 s e uma etapa final de alongamento a 72 °C por 1 min.
      OBS: O tempo de alongamento foi reduzido para 8 s para evitar amplificação do produto de >1.000 pb do primer forward e do primer RV1 no alelo mutante (mutS com inserção IS10).

3. Curva de calibração

1. Misturar as duas amostras de DNA, WT e mutante, nas proporções 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 e 90/10.
   NOTA: As réplicas biológicas são preparadas a partir de culturas bacterianas independentes durante a noite.
2. Amplificar utilizando condições de PCR otimizadas (ver secção 2).
3. Quantificar o produto amplicon.
4. Diluir os produtos de PCR a 0,1 ng/μL.
5. Preparar o instrumento de eletroforese capilar paralela.
   1. Misture gel fresco e corante (kit de análise quantitativa NGS (22, 33 ou 55); Fragmento HS NGS 1-6.000 pb para este exemplo).
      NOTA: Consulte o guia de fragmentos de eletroforese capilar paralela HS NGS para obter instruções detalhadas (consulte a Tabela de Materiais).
6. Substitua a solução de armazenamento capilar e o tampão de entrada e coloque a placa tampão de enxágue nos locais corretos da gaveta do instrumento de eletroforese capilar paralela.
7. Adicionar 2 μL do marcador diluente SH a 22 μL de cada amostra diluída numa placa de 96 poços.
8. Adicione uma escada de tamanho (escada de tamanho de DNA; intervalo de 1-6.000 pb) de um kit de análise quantitativa HS NGS a um poço da placa de 96 poços.
9. Coloque a placa de 96 poços na gaveta correta do instrumento de eletroforese capilar paralela e selecione Executar no software do instrumento de eletroforese capilar paralela.
10. Analise os resultados usando o software de análise de dados, que detecta e identifica cada pico da escada de tamanho, atribuindo cada pico das amostras ao seu tamanho real conhecido.
    1. Ao utilizar um kit quantitativo, utilize o software para determinar a quantidade de DNA de cada fragmento, integrando a área sob o pico, como na análise de dados cromatográficos. Novamente, compare amostras com quantidades conhecidas em padrões para quantificar cada pico de uma amostra e calcule as razões entre os diferentes picos detectados nas amostras.
    2. Construa uma curva de calibração (Figura 2), ligando a proporção conhecida do alelo mutante (mistura de DNA) àquela medida usando o instrumento de eletroforese capilar paralela. Essa curva de calibração permite avaliar a confiabilidade do método e corrigir para pequenos vieses de amplificação.

4. Preparo da amostra

1. Amostras de ponto de tempo de crescimento durante a noite em condições padrão.
2. Extraia o DNA.
3. Quantificar o DNA.
4. Amplificar as amostras utilizando condições de PCR otimizadas (ver secção 2).
5. Executar as amostras no instrumento de eletroforese capilar paralela (ver passos 3.5-3.10).

5. Quantificação alélica

1. Extrair quantidades de alelos mutantes dos dados do instrumento de eletroforese capilar paralela com o software e calcular as proporções reais plotando esses valores na curva de calibração.

Results

Usando DNA extraído de um clone ancestral e um clone hipermutador isolado da população S2.11 na geração 1.000, estabeleceu-se a curva de calibração mostrada na Figura 2. As proporções reais de mutantes a partir de misturas de DNA preparadas em laboratório e medidas pelo instrumento de eletroforese capilar paralela foram ligadas por uma relação linear de inclinação 1,0706, com um R² de 0,9705. Além disso, houve boa concordância entre as réplicas biológicas; O desvio padrão ficou en...

Discussion

Aqui, propusemos um método custo-efetivo que permite acompanhar a dinâmica de alelos emergentes adaptativos de VS em populações de evolução experimental. Este método combina técnicas clássicas de PCR e eletroforese capilar paralela automatizada, permitindo determinar as quantidades relativas de dois alelos. Uma vez configurado, permite a quantificação das proporções alélicas em muitas amostras em paralelo, sendo muito menos dispendioso que o WGS. Este método pode ser visto como um equivalente ao sequenciamento de amplico...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Placa PCR Bem Contornada	4titude	4Ti - 0740	PCR
Grau de biologia molecular de agarose Eurogentec		EP-0010-05	Eletroforese em gel de agarose
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Guia Rápido para os Sistemas Analisadores de Fragmentos	Agilent		PDF guia de instruções
Buffer TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Eletroforese em gel de agarose
Alças e agulhas de inoculação descartáveis calibradas	LABELIANS	8175CSR40H	Cultura bacteriana
Dneasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506	Extração de DNA
Fonte de alimentação de eletroforese	Amilabo	ST606T	Eletroforese em gel de agarose
Analisador de fragmentos Sistema CE automatizado	Agilent		Eletroforese capilar paralela
Escada de DNA de fragmento	Agilent	DNF-396, faixa 1-6000bp	Eletroforese capilar paralela
GENTAMICINA SULFATO DE SAL BIORREAGENTE	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Cultura bacteriana
Marcador diluente de alta sensibilidade	Agilent	DNF-373	Capilar paralelo eletroforese
Kit de análise quantitativa NGS de alta sensibilidade	Agilent	DNF-474	Eletroforese capilar paralela
Escada de carga rápida 1 kb mais escada de DNA	NEB	N0469S	Eletroforese em gel de agarose
LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	Cultura bacteriana
Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L
PCR Primers	Eurogentec		PCR
Software de análise de dados Prosize v.4	Agilent	V.4	Eletroforese capilar paralela
Ensaios de qubit	Invitrogen	MAN0010876	Quantificação de DNA
Qubit dsDNA Kit de ensaio HS	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	Quantificação de DNA
Termociclador	Eppendorf	Ep gradients	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Visualização de eletroforese em gel de agarose
Água para preparação injetável	Aguettant	PROAMP	PCR