Introdução
A pesquisa no campo da nefrologia melhorou significativamente o bem-estar dos indivíduos afetados pela doença renal. No entanto, a doença renal ainda é um grande problema de saúde que afeta mais de 10% da população e é responsável pelo aumento dos custos de saúde e mortalidade em todo o mundo1. Infelizmente, os mecanismos precisos que levam à doença renal não foram totalmente elucidados. Esta coleção de métodos JoVE destaca estratégias recentes para definir a fisiopatologia renal. Especificamente, os grupos de pesquisa apresentam um novo modelo animal e métodos para avaliar ou tratar doenças renais usando modelos experimentais ou amostras clínicas. O trabalho apresentado nesta coleção é outra série de excelentes contribuições para o campo da nefrologia e pode fornecer novos caminhos para prevenir, diagnosticar ou tratar doenças renais no futuro.
Um modelo animal translacional de lesão renal aguda
A lesão renal aguda (LRA) é uma forma comum de doença renal2. Vários modelos experimentais têm sido utilizados para estudar a lesão renal de isquemia/reperfusão (I/R)3,4,5. No entanto, traduzir esses achados para melhorar o cenário clínico tem apresentado muitos desafios, uma vez que existem diferenças significativas entre as espécies6. Doulamis et al. desenvolveram um modelo de I/R renal de suínos usando um cateter-balão bilateral para abordar esse problema7. Seu modelo foi altamente reprodutível, causou redução do débito urinário e da taxa de filtração glomerular estimada e aumentou os níveis de creatinina plasmática e nitrogênio ureico no sangue em animais. Além disso, o exame histológico e de tecido macroscópico revelou infarto e hemorragia nos rins. Este novo modelo é clinicamente relevante e pode ajudar a entender melhor a LRA em humanos.
Estratégias para examinar os mecanismos celulares envolvidos na doença renal
As citocinas podem contribuir para a lesão e reparo renal8. Assim, é importante identificar a fonte e o papel das citocinas no rim. Taguchi et al. desenvolveram uma técnica para entender a secreção de proteínas usando brefeldina A (BFA), um inibidor da secreção de proteínas, em modelos de camundongos com LRA e doença renal crônica9. Eles injetaram BFA na veia da cauda de camundongos e, posteriormente, avaliaram seus rins usando coloração de imunofluorescência. Eles determinaram que o BFA inibiu a secreção de proteínas e causou acúmulo de citocinas em certos tipos de células usando marcadores específicos de células. Este protocolo inovador pode ser usado para estudar a secreção de proteínas em várias patologias renais.
Outro mecanismo proposto que se acredita contribuir para a doença renal são os microRNAs (miRNA)10, que são conhecidos por degradar e inibir a transcrição do mRNA. Foi relatado que existe uma correlação entre a expressão de miRNAs no tecido e o soro em humanos11. No entanto, não existe um método para purificar e quantificar os rins de camundongos e o miRNA sérico. Otimizaram um método quantitativo de reação em cadeia da polimerase em tempo real para avaliar a expressão de miRNAs no rim e no soro de camundongos com insuficiência renal dependente da idade12. Eles também estabeleceram uma correlação entre os dois níveis de miRNA. Este protocolo é de alto rendimento e pode ser aplicável a muitas condições patológicas.
Novas técnicas de imagem para avaliação da doença renal
A imagem não invasiva do rim pode avaliar defeitos estruturais e funcionais. No entanto, existem algumas limitações com os métodos atuais. Para contornar isso, Holmes et al. desenvolveram uma técnica de imagem 3D simples e econômica baseada na tecnologia de ultrassom robótico (US) para quantificar a função renal, hepática e cardíaca13. Seu protocolo forneceu imagens consistentemente de alta qualidade e pode ser usado para estudos em que o tecido macroscópico, o tamanho do tumor ou os benefícios da terapêutica podem ser monitorados. A maior força desse método é a alta saída de dados. Por exemplo, três ratos podem ser fotografados ao mesmo tempo, ou 20 a 30 camundongos podem ser fotografados por hora. Este protocolo é uma alternativa rápida às modalidades tradicionais de imagem não invasiva.
Outro grupo de pesquisa da coleção usou imagens para estudar a obstrução ureteral unilateral (UUO), um modelo de lesão que induz glomérulos superficiais. Wagner et al. usaram microscopia intravital de dois fótons para monitorar UUO em ratos que desenvolvem glomérulos superficiais e naqueles que não desenvolvem glomérulossuperficiais 14. A microscopia de dois fótons fornece uma maior profundidade de penetração e exame de diferentes regiões do rim. Os autores descobriram que o UUO induziu inflamação e fibrose e também diminuiu o fluxo de glóbulos vermelhos nos rins de ratos. Quantificar o fluxo sanguíneo, a vasoconstrição e a dilatação em resposta a medicamentos e inflamação são alguns benefícios que esse método oferece. Coletivamente, esses estudos fornecem novas estratégias de imagem para estudar vários tecidos.
Estimando a nanocristalúria como preditor de doença renal
Foi proposto que a avaliação de cristais urinários poderia ser útil para predizer o risco de cálculos renais15. Desenvolvemos um protocolo para quantificar nanocristais urinários (≤1 μm) de adultos saudáveis antes e depois de consumirem uma carga de oxalato dietética conhecida por induzir níveis de oxalato urinário16. Isolamos e analisamos nanocristais urinários contendo cálcio usando um fluoróforo de cálcio e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Determinamos que o NTA pode detectar especificamente nanocristais contendo cálcio na urina, e os resultados foram consistentes com nossos achados anteriores17. Este protocolo pode ser usado para estudar nanocristais urinários em formadores de cálculos ou em vários campos de pesquisa onde ocorrem cristalopatias.
Abordagens terapêuticas para tratar a doença renal
MiRNAs sintetizados artificialmente têm sido sugeridos como um possível tratamento para a doença renal. No entanto, a RNAase sérica pode degradar miRNAs exógenos18. Yanai et al. produziram vetores não virais baseados em polímero linear, nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), para entregar com segurança um miRNA mimético aos rins de camundongos18. Eles provaram que o mímico era eficaz na superexpressão do miRNA alvo. As limitações deste método incluem a quantidade substancial de PEI-NPs necessárias para modelos animais maiores e a falta de especificidade para os rins. No entanto, com base no sucesso das vacinas de RNA, os miRNAs podem ser uma opção terapêutica ideal para doenças renais.
Observações finais
A pesquisa abrangente apresentada aqui apresenta um novo modelo animal e técnicas para estudar questões prevalentes em torno da nefrologia. É importante observar que alguns desses métodos podem ser aplicados a outras áreas fora da nefrologia. Os próximos passos lógicos serão investigar como esses métodos podem ser testados em modelos animais maiores e ensaios clínicos. Esperamos que o compartilhamento desses protocolos amplie nosso conhecimento sobre fisiopatologia renal e novas ideias de nascimento para mitigar a doença renal em indivíduos.