Aplicação do AlDeSense na Estratificação de Células de Câncer de Ovário com Base na Atividade da Aldeído Desidrogenase 1A1

Resumo

Métodos para medir a atividade de ALDH1A1 em células vivas são críticos na pesquisa do câncer devido ao seu status como um biomarcador de tronco. Neste estudo, empregamos uma sonda fluorogênica isoforme-seletiva para determinar os níveis relativos de atividade de ALDH1A1 em um painel de cinco linhagens de células de câncer de ovário.

Resumo

A recidiva após o tratamento do câncer é frequentemente atribuída à persistência de uma subpopulação de células tumorais conhecidas como células-tronco cancerosas (CSCs), que são caracterizadas por sua notável capacidade de iniciação tumoral e auto-renovação. Dependendo da origem do tumor (por exemplo, ovários), o perfil de biomarcadores de superfície da CSC pode variar drasticamente, tornando a identificação de tais células por meio de coloração imuno-histoquímica um esforço desafiador. Ao contrário, a aldeído desidrogenase 1A1 (ALDH1A1) tem emergido como um excelente marcador para identificar CSCs, devido ao seu perfil de expressão conservado em quase todas as células progenitoras, incluindo CSCs. A isoforma ALDH1A1 pertence a uma superfamília de 19 enzimas que são responsáveis pela oxidação de vários aldeídos endógenos e xenobióticos aos produtos correspondentes do ácido carboxílico. desenvolveram recentemente o AlDeSense, uma sonda "turn-on" isoform-seletiva para a detecção da atividade de ALDH1A1, bem como um reagente de controle de correspondência não reativo (Ctrl-AlDeSense) para explicar a coloração fora do alvo. Esta ferramenta isoform-seletiva já demonstrou ser uma ferramenta química versátil através da detecção da atividade de ALDH1A1 em células de leucemia mielóide K562, mamosferas e xenoenxertos CSC derivados de melanoma. Neste artigo, a utilidade da sonda foi mostrada através de experimentos adicionais de fluorimetria, microscopia confocal e citometria de fluxo, onde a atividade relativa de ALDH1A1 foi determinada em um painel de cinco linhagens de células de câncer de ovário.

Introdução

As células-tronco cancerosas (CSCs) são uma subpopulação de células tumorais que exibem propriedades semelhantes às células-tronco¹. Semelhante aos seus homólogos não cancerosos, os CSCs possuem a extraordinária capacidade de se auto-renovar e proliferar. Juntamente com outros mecanismos incorporados, como a regulação positiva dos transportadores de de ligação de ATP, as CSCs são frequentemente poupadas dos esforços iniciais de remoção cirúrgica, bem como da terapia adjuvante subsequente². Devido ao seu papel crítico na resistência ao tratamento³, recidiva⁴ e metástase

Protocolo

1. Medir a atividade total de ALDH1A1 em homogeneizados de células de câncer de ovário via fluorimetria

1. Descongelar 1 × 10⁶ células num balão de cultura de células T25 em 5 ml dos seguintes meios de cultura celular:
   1. IGROV-1 e PEO4: meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
   2. BG-1 e Caov-3: Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de SFB e 1% de P/S.
   3. OVCAR-3: RPMI 1640 com SFB a 20%, P/S a 1% e insulina a 0,01 mg/mL.
2. Manter as células numa incubadora a 37 °C e 5% CO₂ dura....

Resultados

Atividade total de ALDH1A1 de homogeneizados de células cancerosas de ovário
As dobras médias para cada linhagem celular obtidas neste ensaio são: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); e OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (Figura 2).

Figura 2: Dob.......

Discussão

A pan-seletividade é uma limitação importante de muitas sondas ALDH; no entanto, vários exemplos de isoformas seletivas foram recentemente relatados 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. A sonda.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% Tripsina, 0,1% EDTA em HBSS sem Cálcio, Magnésio e Bicarbonato de Sódio	Corning	25-050-CI
1x Tampão de fosfato Salino	Corning	21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
AlDeSense			Sintetizado internamente
BG-1			Um presente fornecido pelo Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 Garrafa	térmica Fisher Scientific
Armário de Biossegurança Série 1300 A2	Thermo Fisher Scientific
Caov-3			Um presente fornecido pelo Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Homogeneizador de células Urbana-Champaign
	Centrífuga Científica
Fisher 5180R	Eppendorf	22627040
Contrl-AlDeSense			DMEM sintetizado internamente
, 10% FBS, 1% P/S			Preparado pela célula UIUC Tubos
Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo Falcon com Tampa de Pressão de Filtro de Células, 5mL	Corning	352003
FCS Express 6			Fornecido pelo microscópio UIUC CMtO
FL	EVOS
Fluorômetro	Photon Technology International
Forma Series II Water-Jacketed CO2  Incubadora	Fisher Scientific	3110
IGROV-1			Um presente fornecido pelo Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
ImageJ	NIH
Innova 42R Incubated Shaker
LSM 700	Zeiss
LSR II	BD
Sistema de Cobertura de Vidro Borosicilato Nunc Lab-Tek Chambered #1.0	Thermo Fisher Scientific
OVCAR-3	ATCC	HTB-161
PEO4			Um presente fornecido pelo Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Comprimidos inibidores de protease Urbana-Champaign
Pierce	Thermo Scientific	A32963
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
Rocker	VWR
RPMI, 10% FBS, 1% P/S			Preparado pela instalação de mídia celular da UIUC
RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0,01 mg/mL Insulina			preparada pela instalação de mídia celular da UIUC

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