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Artigo de método

Explorando a estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas

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⸱

DOI:

10.3791/64721

⸱

18 de novembro de 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Chengdu Medical College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece uma estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas. O protocolo fornece uma referência para otimizar o melhor modo de aplicação da medicina tradicional chinesa (MTC).

Resumo

Tendo em vista as vantagens da combinação da medicina tradicional chinesa (MTC) no tratamento da isquemia cerebral, estudamos as diferenças na eficácia e no mecanismo entre a combinação de preparação e a combinação de componentes, a fim de explorar a estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas. O cloreto de cobalto (CoCl2) combinado com um meio livre de glicose foi empregado para induzir danos oxidativos das células PC12. Em seguida, a combinação ideal de Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) foi selecionada e combinada seguindo métodos de design uniformes após a triagem de sua concentração segura e eficaz em células PC12. Além disso, a combinação de componentes rastreados compreende 10 μM de astragalosídeo A, 40 μM de escutelarina e 75 μM de ácido clorogênico em duas ervas. Em seguida, MTT, anexina V-FITC/PI, imunofluorescência e Western blot foram utilizados para avaliar a eficácia e o mecanismo da combinação de preparação e da combinação de componentes em células PC12 lesadas. Os resultados mostraram que a combinação de preparação ideal para a pró-sobrevivência celular foi a injeção de Ast e a cápsula de Eri com uma concentração de 6:1,8 (μM). A combinação de componentes (10 μM de astragalosídeo A, 40 μM de escutelarina e 75 μM de ácido clorogênico) foi mais eficaz do que a combinação de preparação. Ambas as combinações reduziram notavelmente a taxa apoptótica, a intensidade de fluorescência da caspase-3 e o nível de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular; enquanto isso, eles regularam positivamente os níveis de expressão de p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax e Nrf2. Esses efeitos foram mais evidentes na combinação de componentes. Em conclusão, ambas as combinações podem inibir a lesão induzida pela CoCl2 combinada com um meio livre de glicose nas células PC12, promovendo assim a sobrevivência celular. No entanto, a eficiência da combinação de componentes sobre a combinação de preparação pode ser devida à sua regulação mais forte da via de sinalização PI3K/Akt/Nrf2 relacionada ao estresse oxidativo e à apoptose.

Introdução

A isquemia cerebral crônica, causada por hipoperfusão cerebral, é uma doença comum em pessoas de meia-idade e idosos1. Como uma doença de isquemia oculta a longo prazo, pode levar a disfunção neurológica progressiva ou persistente. Os principais mecanismos patológicos incluem apoptose celular e dano oxidativo, levando a disfunção neurológica progressiva ou persistente; esta é a base patológica da doença de Alzheimer, demência vascular e outras doenças, e afeta seriamente a qualidade de vida dos pacientes. No entanto, ainda há uma falta de drogas ideais na medicina moderna para tratar a isquemia cerebral crônica2. Ao mesmo tempo, a combinação de Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) tem sido amplamente utilizada na prática clínica da medicina tradicional chinesa (MTC)4. A estratégia de combinação melhorou notavelmente na promoção da recuperação da função nervosa após isquemia cerebral, que é melhor do que a de uma única droga; no entanto, existem grandes diferenças na razão de dosagem na combinação das duas drogas4. Os componentes efetivos e o mecanismo de ação não estão bem definidos, o que é a questão-chave que restringe sua aplicação clínica.

Estudos anteriores demonstraram o efeito sinérgico da combinação de preparação da injeção de Ast e da injeção de Eri no tratamento da isquemia cerebral em ratos. Pode regular positivamente a expressão da proteína p-Akt e regular negativamente a expressão da proteína promotora de morte associada (TAB)Bcl-2 5,6, que é uma das proteínas da família do linfoblastoma B 2 (Bcl-2) e tem o efeito de promover a apoptose. No entanto, a base material e o mecanismo de seu efeito sinérgico não são claros. Além disso, o modelo de lesão de células PC12 foi estabelecido com o meio combinado livre de glicose CoCl2, e a combinação ótima de componentes em Ast e Eri foi rastreada e definida7.

Neste estudo, as doses efetivas de Ast e Eri são rastreadas usando o modelo de célula PC12 lesionado. A combinação ideal das duas drogas é rastreada usando este modelo combinado com o método de design homogêneo. O modelo celular é usado para avaliar melhor a diferença nos efeitos e mecanismos da combinação de preparação e da combinação de componentes em células PC12 lesadas. Esta estratégia visa explorar o efeito protetor e o mecanismo regulador dos dois tipos de combinações em células PC12 lesadas através da via de sinal PI3K/Akt/Nrf2 para determinar o melhor modo de combinação. Este estudo fornece uma referência para otimizar o melhor modo de aplicação do TCM.

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Protocolo

1. Preparação do reagente

  1. Preparar o meio completo adicionando 90 mL de meio DMEM com alto teor de açúcar, 10 mL de soro fetal bovino (FBS) e 1 mL de solução de penicilina-estreptomicina em um frasco de cultura estéril de 125 mL. Misturar o meio completo e conservar a 4 °C em condições fechadas.
  2. Preparar a solução de CoCl 2 adicionando 0,02 g de pó de CoCl2 (pesado com precisão) em 10 ml de meio DMEM sem açúcar (dissolvido completamente) para obter uma solução-mãe de 8,4 mM. Filtrar a solução com um filtro bacteriano de 0,22 μm, selá-la e guardá-la a 4 °C de distância da luz.
    NOTA: CoCl2 é instável e deve ser armazenado em um recipiente hermético, protegido da luz; o período de validade da solução de CoCl2 é de 7 dias.
  3. Preparar solução salina tamponada de Tris-Hcl (TBST).
    1. Pesar com precisão 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio e 3 g de Tris-base. Adicione-os em um copo de 1 L e, em seguida, adicione 1.000 mL de água RO para dissolver a mistura.
    2. Ajustar o pH para 7,4, adicionar 1 ml de Tween 20 e misturar cuidadosamente para obter a solução TBST.
      NOTA: Tween 20 atua como um surfactante para reduzir a ligação inespecífica de anticorpos a antígenos e funciona melhor na concentração de 0,1%.
  4. Preparar a solução de MTT (sal de brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazólio) pesando 0,1 g de MTT em pó em 20 ml de solução PBS para obter uma solução-mãe de 5 mg/ml. Filtrar a solução com um filtro bacteriano de 0,22 μm, selá-la e guardá-la a 4 °C da luz, colocada em modo de espera.
    NOTA: O pó de MTT é instável e absorve facilmente a umidade, por isso deve ser armazenado em um local fechado e seco, longe da luz. A solução de MTT expira após 7 dias. O MTT tem um efeito cancerígeno, por isso evite o contacto direto com a pele.
  5. Preparar a solução da cápsula de Eri removendo o invólucro da cápsula e pesando com precisão 0,18 g do conteúdo em 10 ml de meio sem açúcar DMEM para preparar uma solução-mãe de 100 μM (com base na concentração de escutelarina). Filtrar a solução com um filtro bacteriano de 0,2 μm, selá-la e guardá-la num recipiente hermético a 4 °C.
    NOTA: A escutelarina é o principal ingrediente ativo do Erigeron breviscapus. A concentração de escutelarina nas cápsulas foi determinada por HPLC-UV como sendo de 2,56 mg/g, ou seja, 5,54 μmol/g8. A concentração da preparação é calculada com base na concentração de escutelarina. Isso é conveniente para avaliar a atividade farmacológica da preparação e do componente.
  6. Preparar a solução da injeção Ast adicionando 5 ml de injeção e 5 ml de meio DMEM sem açúcar num tubo centrífugo estéril de 15 ml para preparar uma solução-mãe de 60 μM (com base na concentração de astragalosídeo A). Filtrar a solução através de um filtro bacteriano de 0,2 μm e armazená-la num recipiente hermético a 4 °C.
    NOTA: O volume de injeção é de 10 mL cada, e a concentração de astragalosídeo A na injeção foi determinada pela HPLC-ELSD como sendo de 0,094 mg/mL (ou seja, 120 μM)9. A preparação deve ser realizada em um gabinete de biossegurança e operada de maneira à prova de luz por toda parte. O volume da solução injetável e do meio sem açúcar deve ser medido com precisão e bem misturado.
  7. Preparar a solução de astragalosídeo A pesando com precisão 7,85 mg de astragalosídeo A padrão e dissolvendo-a completamente em 2 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar uma solução-mãe de 5.000 μM. Filtrá-lo com um filtro bacteriano de 0,22 μm e armazená-lo hermético a 4 °C.
    NOTA: O pó de astragalosídeo A é insolúvel no meio sem açúcar. Ao preparar a solução, dissolvê-la com a quantidade apropriada de DMSO para manter a concentração experimental final de DMSO abaixo de 0,1% para garantir que não haja citotoxicidade.
  8. Preparar a solução de escutelarina pesando 11,56 mg de scutellarin standard com precisão e dissolvendo-a completamente com 5 ml de meio DMEM sem açúcar para preparar uma solução-mãe de 5.000 μM. Filtrá-lo com um filtro bacteriano de 0,22 μm e armazená-lo hermético a 4 °C.
  9. Preparar a solução de ácido clorogénico pesando 8,86 mg de ácido clorogénico padrão com precisão e completa dissolvendo-a com 5 ml de meio DMEM sem açúcar para preparar uma solução-mãe de 5.000 μM. Filtrá-lo com um filtro bacteriano de 0,22 μm e armazená-lo hermético a 4 °C.
    NOTA: O pó de ácido clorogênico é instável e absorve facilmente a água. Deve ser selado e armazenado a 4 °C de distância da luz; o tempo de exposição deve ser minimizado durante a pesagem.

2. Ensaio de viabilidade celular

  1. Obter células PC12 e cultivá-las em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
    NOTA: Neste estudo, as células são obtidas da Academia Chinesa de Ciências. As células PC12 são células aderentes que têm as características gerais das células neuroendócrinas e são amplamente utilizadas em neurofisiologia e neurofarmacologia.
  2. Cultivar as células a 37 °C numa incubadora suplementada com 5% de CO 2 e subcultivá-las a cada2-3 dias. Use células nas passagens 4-8 para todos os experimentos.
  3. Cultura celular
    1. Trate as células PC12 na fase de crescimento logarítmico (70%-80% de confluência celular) com 1 mL de tripsina (0,25%) e observe as células ao microscópio. Quando as células se tornarem redondas, pare a digestão da tripsina adicionando 3 mL do meio completo.
    2. Transfira as células para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e centrifugar as células a 840 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante, ressuscite com o meio completo e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, conte o número de células usando um citômetro de fluxo.
      1. Inicie o software de citometria de fluxo, selecione o múltiplo de diluição correspondente da solução celular na configuração de contagem e clique em Gráfico de Densidade depois de carregar a amostra de célula do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      2. Circule a população de células para longe dos eixos X e Y, clique com o botão direito do mouse na tabela de dados abaixo da figura e selecione Contagem X, Y, Contagem e Contagem de Abs. Os dados em Abs Count na tabela de dados fornecem o resultado da contagem de células.
    3. Ajustar a concentração celular para 1 x 10 5 células/mL, inocular 100 μL/poço em placas de 96 poços e cultivar a 37 °C e5 % de CO2 em uma incubadora por 24 h.
  4. Triagem de concentrações seguras de dois fármacos em células PC12 normais
    1. Cultivar as células conforme descrito nas etapas 2.1-2.2. Descarte o sobrenadante e trate as células normais com diferentes concentrações finais de injeção de Ast (4, 8, 12, 16, 20 e 24 μM) e cápsula de Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 e 20 μM). Trate seis poços replicados de cada grupo por 24 h.
      NOTA: As drogas são adicionadas à mídia para atingir a concentração final da droga (mencionada na etapa 2.4.1) e, em seguida, um volume igual de mídia é adicionado a cada poço. Ao aspirar o sobrenadante, a ponta da pipeta deve ser colocada suavemente contra a parede do poço para evitar o contato com as células no fundo do poço. Ao adicionar soluções diferentes, adicione-as suave e rapidamente ao longo das bordas dos poços e preste atenção ao mudar a cabeça da pistola de pipeta para evitar afetar os resultados experimentais.
    2. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 120 μL de solução de MTT (1 mg/ml) a cada alvéolo e incubar as células durante 4 h a 37 °C.
    3. Após a incubação, descarte o sobrenadante novamente e adicione 150 μL de DMSO a cada poço. Agite a placa durante 10 minutos a uma velocidade de 240 vezes/min (número de vibrações horizontais por minuto) utilizando um oscilador de vórtice.
    4. Medir a absorvância de cada amostra a 490 nm utilizando um leitor de microplacas. Calcular a viabilidade celular (%), que é a absorvância do grupo tratado/absorvância do grupo normal (controle) x 100.
      NOTA: Certifique-se de que a solução MTT está dentro do período de validade; se a cor mudou (para verde escuro), ela não pode ser usada. Ao testar a absorvância das células, um poço em branco (meio de cultura e MTT, sem células ou drogas) deve ser ajustado para eliminar a interferência de outros reagentes. Um volume de 150 μL de DMSO é adicionado a cada poço e agitado por 10 minutos para dissolver melhor os cristais azul-púrpura. A absorvância deve ser detectada o mais rapidamente possível para garantir a precisão dos resultados.
  5. Triagem de concentrações efetivas de dois fármacos em células PC12 lesadas
    1. Cultivar as células por 24 h, conforme mencionado nas etapas 2.1-2.2, descartar o sobrenadante e, em seguida, tratar as células com 20 μL/poço de CoCl2 (0,4 mM) combinado com o meio livre de açúcar.
    2. Tratar simultaneamente as células com 100 μL/poço de injeção de Ast (as concentrações finais são 2, 6, 8, 10 e 12 μM) ou 100 μL de cápsula de Eri (as concentrações finais são 1, 2, 3, 4 e 5 μM) a 37 °C por mais 24 h. Adicionar 120 μL/poço de meio completo ao grupo de controlo.
      NOTA: CoCl2 induz condições hipóxicas nas células.
    3. Medir a absorvância de cada amostra pelo método MTT e calcular a viabilidade celular descrita anteriormente nas etapas 2.4.2 e 2.4.3.
  6. Triagem da combinação ótima de dois fármacos com base no método de delineamento homogêneo
    NOTA: Após a obtenção da faixa de concentração efetiva da injeção de Astragalus e da cápsula de breviscapus,utilizou-se a tabela do método de delineamento uniforme U 7 (74) para obter seis combinações diferentes dos dois fármacos. Injeção de Ast:Eri cápsula: 1) 2:2.6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1.8 μM, 4) 8:4.2 μM, 5) 10:1 μM, e 6)12:3.4 μM.
    1. Cultive as células, conforme descrito acima na etapa 2.3.1, e trate as células PC12 lesadas com concentrações de seis proporções de injeção de Ast:cápsula de Eri, conforme mencionado acima.
    2. Tratar as células durante 24 h e calcular a viabilidade celular conforme descrito anteriormente nos passos 2.4.2 e 2.4.3.
  7. Avaliação do efeito protetor de duas combinações ótimas em células PC12 lesadas
    NOTA: Após a obtenção da combinação de preparação ideal (injeção de Ast:cápsula de Eri de 6:1,8 μM) e a combinação ótima de componentes7 (astragalosídeo A de 10 μM, escutelarina de 40 μM e ácido clorogênico de 75 μM), uma avaliação adicional é realizada para verificar seus efeitos protetores nas células PC12 lesadas.
    1. Cultive as células conforme descrito acima na etapa 2.3.1 e trate as células PC12 lesadas com os dois tipos de combinações de drogas, conforme discutido na NOTA acima.
    2. Tratar as células durante 24 h e calcular a viabilidade celular conforme descrito anteriormente nos passos 2.4.2 e 2.4.3.

3. Ensaio de anexina V-FITC/PI para a taxa de apoptose

  1. Semeia as células PC12 numa placa de 12 poços a uma concentração de 1,3 x 105 células/poço e cultura-as a 37 °C durante 24 h.
  2. Agrupe as células: grupo controle, grupo modelo e duas combinações de drogas. Adicionar 1,2 mL/poço de meio completo ao grupo controle, adicionar 1,2 mL/poço de meio contendo 0,4 mM de CoCl 2 ao grupo modelo e adicionar 1,2 mL/poço de cada uma das duas combinações contendo 0,4 mM CoCl2. Incubar as células a 37 °C durante mais 24 h.
  3. Após o tratamento medicamentoso, tratar as células com 250 μL/poço de tripsina, transferir as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 840 xg por 5 min à temperatura ambiente (RT). Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL do tampão de ligação.
    1. Incubar as células no escuro com 5 μL de anexina V-FITC e 10 μL de iodeto de propídio (PI) por 15 min no RT e, em seguida, verificar se há apoptose por citometria de fluxo. Defina três poços replicados em cada grupo.
      NOTA: A tripsina utilizada neste ensaio não pode conter EDTA porque o EDTA é um agente quelante de iões metálicos que compete com a anexina V para ligar os iões cálcio e afecta a afinidade da anexina pelo PI. Quando ocorre apoptose, a fosfoserina, originalmente no lado interno da membrana celular, volta-se para fora para a superfície celular, e a anexina V-FITC se liga seletivamente à fosfoserina fora da membrana para mostrar fluorescência verde.
    2. Clique em Compensação Automática no menu Iniciar , selecione FITC, PE, PerCP e APC no canal Selecionar e selecione Compensação em: Altura. Clique em OK no item estatístico: mediana. Com o mesmo método de contagem de células mencionado na etapa 2.3.2, colete as amostras de células, clique no Mapa de Densidade e circule a população de células efetiva.
    3. Com a fluorescência FITC como o parâmetro do eixo X e outros parâmetros de fluorescência como o parâmetro do eixo Y, crie um mapa de densidade. Clique em Matriz de compensação no menu Iniciar e Coeficiente na matriz de estouro. As informações do mapa de densidade são exibidas para a análise da taxa de apoptose.

4. Detecção por imunofluorescência da geração de caspase-3

  1. Semeia as células PC12 em folhas de cobertura a uma densidade de 8 x 104 células/folha de cobertura e coloque-as em placas de 24 poços a 37 °C durante 24 h. Agrupar as células como mencionado acima na etapa 3.2; configurar três folhas de cobertura replicadas para cada grupo.
  2. Após o tratamento medicamentoso, enxaguar as coberturas duas vezes com PBS (37 °C) por 5 min cada, fixá-las com paraformaldeído a 4% por 15 min e permeabilizar com Triton X-100 a 0,5% por 20 min no TR.
  3. Enxaguar as células novamente e bloqueá-las com soro de cabra a 10% por 1 h no RT.
  4. Incubar cada folha de cobertura com 200 μL de anticorpo primário caspase-3 (uma proteína executiva chave da apoptose) diluído a uma concentração de 1:250 em 1x TBST, durante a noite a 4 °C. Lavar com 1x TBST (três vezes por 3 min cada) e incubar com 200 μL de anticorpo secundário (diluição de 1:300 em 1x TBST) por 1 h em RT no escuro.
    NOTA: A fluorescência é facilmente extinta; assim, após a incubação do anticorpo secundário, as lâminas devem ser mantidas longe da luz. Os anticorpos primários e secundários devem ser armazenados a 4 °C de distância da luz.
  5. Adicione 300 μL de DAPI (0,5 μg/mL) às coberturas (para detectar os núcleos) por 10 min e lave as células três vezes com 1x TBST por 5 min cada.
  6. Observe as coberturas sob o microscópio de fluorescência e capture as imagens10. Realizar análise estatística da intensidade de fluorescência utilizando o software de imagem.
    NOTA: As corrediças e as tampas utilizadas devem ser limpas e estéreis. Ao colorir, preste atenção ao pH, concentração e temperatura da solução de tingimento e evite a têmpera por fluorescência. O microscópio fluorescente deve ser ligado com pelo menos 15 min de antecedência para pré-aquecer a lâmpada de mercúrio e desligado por 30 min antes de ser ligado novamente. Ao adquirir imagens, os parâmetros de exposição do mesmo corante no mesmo lote de experimentos devem ser consistentes para garantir a precisão dos resultados.

5. Ensaio de imunofluorescência do nível de EROs

  1. Cultivar e tratar as células conforme discutido na etapa 4.1.
  2. Após o tratamento medicamentoso, lavar cada folha de cobertura três vezes com PBS por 3 min e incubar com 400 μL de DCFH-DA (10 μM) a 37 °C por 20 min.
    NOTA: DCFH-DA é um indicador universal de estresse oxidativo. Tem permeabilidade à membrana celular e sem fluorescência. Uma vez que entra na célula, é hidrolisado pela esterase para produzir 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH) e, em seguida, rapidamente oxidado para produzir um produto fluorescente forte.
  3. Lave as células novamente com DMEM sem soro (duas vezes por 3 min cada) e observe imediatamente a tampa após adicionar o agente de têmpera de fluorescência sob o microscópio de fluorescência. Calcule a intensidade relativa de fluorescência pelo software de imagem.
    Observação : depois de carregar o teste DCFH-DA, certifique-se de limpar o teste residual que não entra na célula, caso contrário, o plano de fundo ficará alto.

6. Detecção de Western blot da expressão proteica de Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 e Bax11,12

  1. Inocular células PC12 em placas de 6 poços na concentração de 1 x 106 células/poço e cultura a 37 °C durante 24 h. Agrupe e trate as células como mencionado na etapa 4.1 e defina três poços replicantes em cada grupo.
  2. Após o tratamento medicamentoso por 24 h, lavar as células três vezes com PBS por 5 min cada e incubar no gelo por 30 min em tampão de lise preparado. Após a lise, centrifugar as células por 20 min a 16.000 x g e 4 °C e coletar os sobrenadantes.
  3. Detectar a concentração de proteína e ajustar de acordo com as instruções através do ensaio de Bradford. Diluir as amostras e desnaturar a 100 °C durante 10 minutos.
    NOTA: O tampão de lise é composto por inibidor de fosfatase, inibidor de protease e lisado de RIPA em uma proporção de volume de 1:1:50. No grupo controle, são necessários 200 μL/poço de tampão de lise e 100 μL/poço de tampão de lise nos outros grupos. Geralmente, as concentrações proteicas dos grupos controle, modelo e dois tipos de combinações são 0,45 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,32-0,39 mg/mL, respectivamente; suas concentrações de proteína após diluição com o tampão de carga são de 0,36, 0,2 e 0,256-0,312 mg/mL, respectivamente.
  4. Para detectar proteínas com diferentes pesos moleculares, carregue 25 μg de proteína em cada pista, execute uma eletroforese SDS-PAGE de 12% e transfira o gel para membranas PVDF.
    NOTA: Durante a preparação do gel SDS, ele deve ser totalmente misturado sem bolhas ou partículas insolúveis; caso contrário, bandas irregulares ou irregulares podem ocorrer. Ao transferir as membranas, certifique-se de que não há bolhas entre a membrana PVDF e o gel; caso contrário, manchas brancas aparecerão na tira. Além disso, essa etapa deve ser realizada em baixas temperaturas, e o saco de gelo deve ser trocado a cada 30 min.
  5. Bloquear as membranas com leite desnatado a 5% por 1,5 h no RT e incubar com 5 mL dos anticorpos primários correspondentes (Nrf2 1:1.000, Akt 1:2.000, p-Akt 1:2.000, Bcl-2 1:5.000 e Bax 1:1.000) por 24 h a 4 °C. Use β-actina (1:5.000) como controle interno.
  6. Lavar as membranas com TBST (três vezes por 10 min cada) e, em seguida, incubar com 5 mL de anticorpos secundários conjugados com HPR (1:5.000) no RT por 2 h.
    NOTA: A razão de diluição dos anticorpos não deve ser alterada arbitrariamente, e as membranas devem ser lavadas com TBST suficientemente de acordo com os requisitos para evitar que a cor de fundo da banda seja demasiado preta.
  7. Finalmente, lave a membrana com TBST novamente e trate-a com substrato quimioluminescente HRP (de acordo com as instruções do fabricante) para detecção de banda de proteína. Capturar as imagens utilizando o sistema de imagem quimioluminescência e quantificar os valores de cinza das proteínas utilizando o software de imagem, com β-actina como controle interno comparativo.

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Resultados

A triagem da combinação ideal de injeção de Ast e cápsula de Eri é mostrada na Figura 1. A taxa de sobrevivência celular da injeção de Ast e da cápsula de Eri nas células PC12 normais é mostrada na Figura 1A. A viabilidade celular foi inferior a 95% com injeção de Ast em concentrações superiores a 12 μM (Figura 1A) e cápsula de Eri em concentrações superiores a 5 μM (Figura 1A), indicando que a concentração máxima não tóxica foi de ...

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Discussão

Ainda há carência de medicamentos ideais para o tratamento da isquemia cerebral na prática clínica moderna2. Sob a orientação da suplementação de qi e ativação do método de circulação sanguínea, Ast, Eri e outras preparações têm sido utilizadas em combinação na prática clínica da MTC e têm alcançado boas vantagens abrangentes13,14,15. Um grande número de estudos tem demonstrado que o Ast pode melhorar a p...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada por projetos-chave de P & D do Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2020YFS0325).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Gabinete de biossegurança classe II da série 1300Thermo Fisher Scientific Instruments Company1374
Brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólioGuangzhou saiguo biotech Company1334GR001MTT
ACEA NovoExpress  1.4.0ACEA Biosciences,Inc-Akt
Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc10176-2-AP
Citometria de fluxo analíticaThermo Fisher Scientific Instruments Company62-2-1810-1027-0
Kit de detecção de apoptose Annexin V-FITCBeyotime Biotechnology CompanyC1062L
Injeção de astrágaloHeilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical CompanyA03190612144injeção de Ast
Astragaloside AChongqing Gao Ren Biotechnology Company84687-43-4
BaxWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc60267-1-Ig
Kit de quantificação de proteína BCABeyotime Biotechnology CompanyP0012
Bcl-2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc26593-1-AP
Incubadoras de dióxido de carbonoThermo Fisher Scientific Instruments Company0816-2014
Caspase-3Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc19677-1-AP
Ácido clorogênicoChongqing Gao Ren Biotechnology Company327-97-9
Cloreto de cobalto hexahidratadoMerck Biotechnology, Inc.7791-13-1CoCl2
Dimethyl sulfoxideGuangzhou saiguo biotech Company2020112701DMSO
Hidrogenofosfato dissódico dodecahidratadoChengdu Kolon Chemical Company2020090101
DMEM alto teor de açúcar médioThermo scientific Hyclone2110050
DMEM meio sem açúcarBeijing Solarbio life sciences Company
ECL fluido luminosoLianshuo Biological CompanyWBKLS0500
Balança eletrônicaHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Xangai, ChinaFA1204
Instrumento de eletroforeseBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1658026
Erigeron breviscapus cápsulaYunnan Biogu Pharmaceutical CompanyCápsula Z53021671Eri
Soro bovino fetalInstituto de Engenharia Biológica Four Seasons de Engenharia Biológica20210402FBS
Microscópio fluorescenteOlympms CorporationIX71-F32PH
Gerador de imagens em gelBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1708265
Anticorpo secundário anti-rato de cabraWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001-1
Anticorpo secundário anti-coelho de cabraWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001- 2
IBM SPSS Statistics versão 26.0International Business Machines Corporation, USA-ImageJ
1.8.0National Institutes of Health, USA-software deimagem
Immunol  fluorescência  kit de coloraçãoBeyotime Biotechnology CompanyP0196
KClChengdu Kolon Chemical Company2021070901
MarcadorThermo Fisher Scientific Instruments Company26616
Leitor de microplacasPerkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.
Motic microscópio invertidoNanda Scientific Instruments Co.
NaClChengdu Kolon Chemical Company2014081301
Leite desnatadoBeyotime Biotechnology CompanyP0216
Nrf2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc16396-1-AP
P-AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66444-1-Ig
PC12 célulasChinesa de Ciências
Solução de penicilina-estreptomicinaThermo scientific HycloneSV30010
Mistura de inibidores de protease de fosfataseBeyotime Biotechnology CompanyP1045
Di-hidrogenofosfato de potássioChengdu Kolon Chemical Company2015082901
Kit de ensaio de espécies reativas de oxigênioBeyotime Biotechnology CompanySolução de lise S0033S
RI-PABeyotime Biotechnology CompanyP0013B
ScutellarinChongqing Gao Ren Biotechnology Company27740-01-8
Tampão de carregamento de amostras SDS-PAGE, 5xBeyotime Biotechnology CompanyP0015L
Pontas de filtro estéreis (0,22 µ m)Merck Biotecnologia, Inc.
Tris-baseGuangzhou saiguo biotech Company1115GR500 Tbs
TrypsinThermo científico HycloneJ190013
Tween-20Chengdu Kolon Chemical Company2021051301
oscilador de vórticeOHAUS International Co., Ltd., Xangai, ChinaVXMNAL
β-actinaWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66009-1-IG
2029548HH35L2018296AE2000LED Academia CBP60430SLGP033RB

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