Estratégia baseada em CRISPR em uma etapa para marcação gênica endógena em Drosophila melanogaster

As proteínas fluorescentes têm emergido como poderosas ferramentas para visualizar a localização, a dinâmica e as interações proteína-proteína em células de organismos vivos ^1,2. A marcação de genes endógenos com proteínas fluorescentes permite imagens ao vivo de longo prazo de processos celulares com resolução subcelular. Além disso, essas técnicas endógenas de marcação gênica apresentam diversas vantagens em relação às abordagens de superexpressão e imunomarcação. Por exemplo, a superexpressão de proteínas pode levar a enovelamento incorreto de proteínas, interações proteína-proteína inespecíficas e localização incorreta³. Até o momento, os pesquisadores conseguiram criar vastas bibliotecas de genes endógenos fundidos a proteínas fluorescentes para alguns organismos modelo, como leveduras em brotamento, que podem sofrer eficiente recombinação homóloga⁴. No caso de Drosophila melanogaster, várias ferramentas, como MiMICs⁵, armadilhas intensificadoras baseadas em transposon⁶ e fosmidas⁷, foram desenvolvidas para marcar genes fluorescentemente.

O desenvolvimento de ferramentas baseadas em CRISPR-Cas9 tornou possível realizar eficientemente a edição do genoma, incluindo a marcação de proteínas endógenas, em uma ampla gama de organismos modelo ^8,9. Cas9 é uma enzima guiada por RNA que cliva DNA de fita dupla de maneira altamente eficiente e específica⁸, que pode então ser reparada por uma via de junção final não homóloga (NHEJ) levando a mutações pontuais ou deleções. Alternativamente, a via de reparo dirigido por homologia (HDR) permite a integração do DNA heterólogo no cromossomo.

Métodos anteriores para marcação gênica baseada em CRISPR no organismo modelo, Drosophila melanogaster, basearam-se em um processo de duas etapas 10,11,12. Isso envolve o uso de um marcador de cor de olho discernível, Dsred, para detectar eventos HDR bem-sucedidos. Posteriormente, o marcador Dsred seria excisado usando o sistema de recombinação Cre/loxP. Para agilizar e agilizar esse processo, apresentamos aqui um método mais simples e eficiente. Essa abordagem contorna a necessidade de genotipagem letal e permite a triagem direta de moscas individuais. Especificamente, empregamos uma abordagem baseada em PCR para extrair DNA de um pequeno segmento da perna média da mosca, permitindo-nos genotipar moscas individuais. Notavelmente, este procedimento não compromete a vitalidade, o movimento ou as capacidades reprodutivas da mosca amostrada. Apenas os indivíduos apropriados, identificados através deste método, são desenvolvidos em estoques estáveis.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para geração de moscas marcadas com proteínas fluorescentes em que genes endógenos são marcados com repórteres fluorescentes. Esta técnica usa a edição do genoma CRISPR-Cas9 para fundir qualquer etiqueta de fluoróforo desejada ao terminal N- ou C- de um gene endógeno. Abaixo, descrevemos o projeto e a construção de plasmídeos de gRNA e de um plasmídeo doador, a estratégia de triagem em uma etapa para selecionar moscas CRISPR-positivas e as etapas para estabelecer linhagens estáveis. Especificamente, descrevemos estratégias para marcar um gene endógeno do relógio central Drosophila, ponto, com um fluoróforo no C-terminal. Também descrevemos brevemente os experimentos de controle que precisam ser realizados para confirmar que a proteína marcada é funcional e técnicas de imagem ao vivo para visualizar a proteína Period em neurônios de relógio vivos dentro de cérebros intactos de Drosophila ¹³. O protocolo descrito aqui também é amplamente aplicável para selecionar candidatos para deleções e inserções de pedaços específicos de DNA por edição do genoma CRISPR-Cas9.

1. Projeto e construção de reagentes de edição gênica

NOTA: Para realizar a marcação endógena, é essencial identificar as várias isoformas do gene desejado. Dependendo dos objetivos específicos do experimento, um tag fluorescente pode ser incorporado internamente ou no termini N ou C da(s) isoforma(s) de proteína selecionada(s). Para uma edição mediada por CRISPR ideal, é crucial posicionar os dois sgRNAs adequadamente perto do local de knock-in pretendido. Posteriormente, para permitir a edição por meio de recombinação homóloga, um vetor doador englobando sequências homólogas ao gene alvo, juntamente com a etiqueta fluorescente, deve ser preparado. Abaixo está um guia passo a passo para esses processos (Figura 1).

1. Projete o sgRNA conforme descrito abaixo.
   1. Projetar sgRNAs para Drosophila usando estes sites: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ ou http://www.flyrnai.org/crispr2/.
   2. Para o site flycrispr, digite a sequência ±100 pb ao redor do local de knock-in desejado (terminal N, terminal C ou qualquer locus genômico de interesse). Se usar o nos-Cas9 attP2 como fundo de injeção, escolha a opção de genoma Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). O sistema Nos-Cas9 garante a expressão de Cas9 específica da linha germinativa.
   3. Para melhorar a eficiência da expressão de sgRNA, selecione os alvos CRISPR com a opção 5' G , pois os sgRNAs que começam com uma guanina aumentarão a atividade de edição. Em seguida, clique no botão Localizar destinos CRISPR . Uma lista de possíveis sequências de sgRNA será exibida.
   4. Para cada sequência, clique no botão Avaliar . Esta ação verifica se há potenciais alvos fora para cada sequência com base no genoma previamente selecionado. Na lista fornecida, escolha 2 sgRNAs que têm 0 alvos desativados. Certifique-se de que um sgRNA esteja a montante e o outro a jusante em relação ao local de entrada. Idealmente, suas posições devem ser o mais próximo possível do local de batida (<200 pb), mas não devem se sobrepor entre si (Figura 2).
      NOTA: Às vezes, pode ser difícil encontrar sgRNAs apropriados para um determinado gene alvo. A lacuna entre os sgRNAs e o local de knock-in pode ser aumentada para ± de 200 pb. O uso de sgRNAs não iniciados com G pode diminuir ligeiramente a taxa de positividade.
2. Execute a seleção de tags fluorescentes conforme descrito abaixo.
   1. Os tags fluorescentes oferecem uma gama diversificada de características, cada uma com suas vantagens e desvantagens únicas ^1,2. Ao determinar a etiqueta fluorescente ideal para rotular uma proteína específica, cuide das principais considerações descritas nas etapas a seguir.
   2. Dado que os níveis de expressão proteica natural são tipicamente muito mais baixos do que aqueles observados em experimentos de superexpressão ^1,2, comece com as etiquetas que são brilhantes e fotoestáveis e que se encaixam na configuração experimental. Algumas etiquetas fluorescentes, especificamente certas RFPs como tdTomato e DsRed, tendem a formar multímeros¹⁴ e podem levar à agregação de proteínas.
   3. Para maior versatilidade, vincule etiquetas de epítopo (por exemplo, FLAG ou V5) ao marcador fluorescente usando um ligante flexível, que permite análises bioquímicas como Western Blot ou Co-Imunoprecipitação.
3. Para o design do vinculador, siga as etapas descritas abaixo.
   1. Para uma funcionalidade ideal, certifique-se de que tanto a proteína endógena de interesse quanto a etiqueta fluorescente se dobrem separadamente em suas respectivas formas funcionais. Para conseguir isso, use um peptídeo ligante que varia de 2-20 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, coloque dois resíduos de glicina entre o último aminoácido da proteína Period e o primeiro aminoácido da proteína fluorescente mNeonGreen.
   2. Assegurar que essas sequências peptídicas ligantes sejam compostas por aminoácidos como glicina e serina, que conferem flexibilidade à estrutura¹⁵. Isso garante que o comportamento natural e a localização da proteína endógena permaneçam inalterados.
4. Projetar vetor doador conforme descrito abaixo.
   NOTA: O vetor doador introduz o tag fluorescente no local endógeno desejado através do processo de reparo dirigido por homologia, que é iniciado pela clivagem CRISPR. Assim, além da etiqueta fluorescente, o vetor doador deve possuir sequências homólogas em ambos os lados da etiqueta.
   1. Comece o projeto do vetor doador organizando a sequência de DNA do peptídeo ligante e da etiqueta fluorescente e certifique-se de que haja sequências homólogas flanqueando ambas as extremidades (braços de homologia). Para obter os melhores resultados, assegure-se de que os braços de homologia abranjam pelo menos 800 nucleotídeos de cada lado do local de knock-in pretendido (Figura 2).
      NOTA: Relatos recentes sugerem que os braços de homologia podem ser mais curtos (100-200 pb)¹⁶.
   2. Certifique-se de que quaisquer sequências PAM dentro do plasmídeo do doador sejam modificadas de tal forma que a sequência de aminoácidos da proteína resultante permaneça inalterada. Se a sequência PAM estiver localizada no UTR, remova-a completamente.
   3. O posicionamento do códon START e STOP depende da localização do tag. Para marcação interna, certifique-se de que a etiqueta fluorescente esteja no quadro com a sequência codificadora do gene alvo. Para a marcação N-terminal, posicione o tag fluorescente antes do códon de início endógeno. Para marcação C-terminus, situe a etiqueta fluorescente antes do códon de parada natural e certifique-se de reter apenas um único códon inicial para evitar possíveis problemas de tradução.
5. Sintetizar sgRNA e plasmídeos de doadores conforme descrito abaixo.
   1. Para a criação de plasmídeos de sgRNA, siga as diretrizes de clonagem de U6-gRNA, que podem ser encontradas em flycrispr.org/protocols/grna/. Empregar a abordagem alternativa de clonagem baseada em enzimas de restrição (referida como estratégia C no recurso fornecido) para inserir a sequência de gRNA no plasmídeo pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).
   2. Transforme em DH5a E. coli (NEB, C2987H) seguindo protocolos de transformação padrão fornecidos pelo fabricante. Para verificação, realize o sequenciamento de Sanger nos clones resultantes usando primers de sequenciamento padrão T3 ou T7.
   3. Para a criação do plasmídeo do dador, adquira ADN de fita dupla com a sequência de dador desejada junto de fornecedores comerciais (por exemplo, IDT). Integre-o ao site de clonagem múltipla pBlueScriptII SK(-). Sequenciar o plasmídeo doador para garantir que as sequências de sgRNA ou PAM sejam modificadas corretamente e não haja SNPs presentes no plasmídeo.
      NOTA: Uma alternativa para a integração usando pBlueScriptII é PCR os braços de homologia e os segmentos de tag fluorescente separadamente e consolidá-los no backbone usando técnicas como Golden Gate Assembly ou Gibson Assembly.
6. Use o seguinte esquema de injeção e cruzamento.
   1. Para adquirir moscas editadas pela linha germinativa, co-injete plasmídeos de gRNA e o plasmídeo do doador no fundo Cas9 apropriado (por exemplo, nos-Cas9 III, BDSC 78782). Se estiver utilizando serviços de injeção comercial, siga as instruções do fornecedor para realizar a preparação do plasmídeo.
      NOTA: Normalmente, a concentração plasmidial de gRNA deve exceder 0,5 μg/μL, e a concentração de plasmídeo do doador deve estar acima de 1,0 μg/μL. Um cronograma comum desde o envio de amostras de plasmídios até o recebimento de embriões injetados é de aproximadamente 2 semanas. Uma estratégia para rastrear eventos de edição gênica no cromossomo X empregando a cepa balanceadora FM7/L é apresentada aqui. Para genes no segundo ou terceiro cromossomo, empregar as cepas balanceadoras apropriadas.
   2. Para a coleta de moscas injetadas (G0), anestesiar com dióxido de carbono e separar moscas machos e fêmeas virgens. Estabelecer cruzamentos de moscas emparelhando cada macho G0 com pelo menos duas fêmeas virgens FM7/L em frascos de alimento CT estreitos individuais. Coloque os frascos cruzados em uma incubadora ventilada mantida a 25°C e ~60% de umidade até que as moscas F1 se aproximem (FM7/L é o balanceador de cromossomo X mais comumente usado). Da mesma forma, emparelhe cada fêmea G0 com moscas machos FM7/Y.
   3. Anestesiar e coletar pelo menos 10 filhotes virgens fêmeas (F1) de cruzamentos G0 machos e fêmeas. Dos cruzamentos femininos G0, encontram-se pelo menos 10 moscas F1 machos (Figura 3A). Certifique-se de que cada mosca de F1 seja marcada com os detalhes de sua filiação e armazenada separadamente. Prossiga para a etapa de triagem.
7. Use o seguinte protocolo de PCR de perna única.
   1. Criação de primer: Crie um par de primers englobando o local de edição do gene alvo. O ideal é que as temperaturas de fusão dos primers sejam semelhantes, em torno de 55°C.
   2. Preparação do tampão de lise: Preparar 10 μL de tampão de lise para cada amostra de mosca. O tampão consiste em 10 mM Tris (pH 8,2), 1 mM EDTA (pH 8,0), 25 mM NaCl e 400 μg/mL de proteinase K. Prepare o tampão de lise como uma mistura mestra e, em seguida, distribua 10 μL em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. Certifique-se de que o tampão permaneça frio durante todo o processo de dissecção da perna (Figura 3B).
   3. Configuração do tubo: Prepare tubos capilares de vidro, preenchendo uma extremidade com alimento de ágar-sacarose (2% ágar e 4% sacarose), e coloque-os em uma placa de poço profundo de 96 poços, que será chamada de fly hotel (Figura 3C).
   4. Dissecção da perna: Coloque a almofada de anestesia de dióxido de carbono sob um microscópio estéreo, anestesiar uma mosca candidata e cortar uma das pernas médias. Coloque a perna no tampão de lise, garantindo a imersão completa. Não é necessário macerar a perna, procedendo diretamente à etapa do protocolo de lise (Figura 3B). Segure a asa da mosca com um par de pinças finas de metal, mova a mosca para o hotel da mosca e sele o tubo com fio imediatamente.
   5. Amostras de controlo: Duas moscas selvagens podem ser utilizadas como controlos negativos após o mesmo procedimento de dissecção das pernas. Um plasmídeo de doador diluído serve como controle positivo.
   6. Cuidados pós-dissecção: Alojar o hotel de moscas em uma incubadora ventilada mantida a 25 °C e ~60% de umidade. Embora as moscas possam sobreviver durante a noite, recomenda-se completar as etapas subsequentes e acasalar no mesmo dia.
   7. Protocolo de lise: Colocar as pernas decepadas na solução tampão de lise em um termociclador regulado a 37 °C por 90 min, seguido de 95 °C por 5 min, finalmente mantido a 4 °C. Isso extrairá DNA suficiente da perna única de cada mosca (Figura 3B).
   8. Reação de PCR: Organizar a reação de PCR conforme as instruções do fabricante, utilizando 1,5 μL de lisado da perna de mosca como fonte de DNA.
   9. Eletroforese em gel: Submeter os produtos de PCR à eletroforese em gel de agarose. Interpretar os resultados do gel com base no tamanho da banda. Normalmente, as moscas de controle negativo exibirão uma banda mais baixa, e os controles plasmidiais positivos exibirão uma banda mais alta. Certifique-se de que os tamanhos de banda específicos sejam consistentes com o design original do plasmídeo do doador. As fêmeas positivas apresentarão duas bandas por serem heterozigotas e os machos positivos apresentarão uma única banda (Figura 3B).
      NOTA: Normalmente, a triagem de 70 moscas é possível em um único dia. Certifique-se de identificar um mínimo de 10 moscas F1 positivas em 4 a 5 cruzamentos G0 distintos, pois certos F1s podem ser estéreis devido a mutações fora do alvo.
8. Realize a seguinte configuração cruzada pós-PCR.
   1. Com base nos resultados do gel, selecione as moscas positivas do hotel de moscas e cruze-as individualmente com moscas balanceadoras (FM7/L para marcação de genes do cromossomo X) para produzir a geração F2. Uma vez que a geração F2 surge, estabeleça cruzamentos irmãos para criar estoques estáveis homozigotos (Figura 3D).
   2. Use estoques homozigotos para o sequenciamento Sanger do site de edição para garantir a precisão. Backcross validou linhas de moscas com moscas selvagens para remover mutações de fundo. Rastreie cada geração usando o protocolo de PCR de perna única.

Em nossos experimentos, tipicamente encontramos uma taxa de sucesso de ~20%-30% na triagem de vários genes marcados endógenos em todos os cromossomos (X, II, III). A eficiência desse processo pode variar com base em vários fatores, como a seleção do gRNA, a natureza do gene e a qualidade da injeção. Aqui, ilustramos os resultados de nossa estratégia de marcar o gene do período endógeno com o fluoróforo mNeonGreen13. O gene do período , posicionado no cromossomo X de D. melanogaster, desempenha um papel fundamental no relógio circadiano. Drosophila possui uma rede de relógios bem caracterizada composta por aproximadamente 150 neurônios-relógio que expressam proteínas do relógio17.

Nós marcamos a proteína Period com a proteína fluorescente verde mNeonGreen em sua extremidade C-terminal, conectada por um ligante de glicina dupla13. Após a injeção do plasmídeo, cruzamos as moscas G0 com o balanceador FM7/L e, posteriormente, colhemos a geração F1. Das 126 moscas F1 triadas com iniciadores especializados em PCR (Tabela 1), identificamos 47 casos positivos, com uma taxa de sucesso de 37,3%. Destes, foram selecionados 5 indivíduos F1 para montar cruzamentos adicionais para produzir estoques estáveis. O gênero não influenciou a taxa de desfecho positivo durante essa triagem. Após a verificação da precisão da sequência do gene marcado, foram realizados testes de controle, incluindo avaliações comportamentais e avaliações de qPCR para garantir oscilações de RNAm para confirmar a funcionalidade da proteína marcada (PERIOD-mNeonGreen)13.

Para realizar experimentos de imagem ao vivo, cruzamos essas moscas PERIOD-mNeonGreen com Clock856-GAL4; UAS-CD4-tdTomato voa, onde Clock856-GAL4 rotula todos os neurônios relógio19 e CD4 é uma proteína transmembrana que marca as membranas celulares. Para experimentos de imagem ao vivo, dissecamos 3-4 cérebros adultos usando o meio Drosophila de Schneider gelado. Os cérebros foram montados e fotografados usando um microscópio confocal Airyscan. A Figura 4 mostra as imagens representativas mostrando a proteína PERIOD dentro dos neurônios-relógio em cérebros de Drosophila .

Figura 1: Esquema do protocolo de edição genética baseado em CRISPR/Cas9. O protocolo descreve uma série de etapas para projetar e montar plasmídeos de sgRNA e doadores, seguido de triagem por meio do método de PCR de perna única e produção de linhas de engenharia estáveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Esquema de edição do genoma CRISPR/Cas9 para gerar moscas men-mNeonGreen. (A) Esquema que ilustra a adição de uma etiqueta de proteína fluorescente ao C-terminal de um gene endógeno. (B) O gene do período endógeno (per) é marcado com mNeonGreen, uma proteína fluorescente verde monomérica brilhante no terminal carboxila. Dois sgRNAs estão no último exon e no 3'UTR, respectivamente. O vetor doador contém duas sequências de homologia de ~1 kb flanqueando a tag mNeonGreen. O códon Stop é adicionado ao final da tag para o término adequado da tradução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Estratégia para rastrear moscas CRISPR-positivas. (A) Abordagem para estabelecer cruzamentos genéticos de pré-triagem para genes destinados à marcação CRISPR nos cromossomos X e II. G0 denota as moscas inicialmente injetadas, enquanto F1 representa sua prole de primeira geração que requer triagem. (B) O método de triagem por PCR de perna única e a duração de cada etapa do procedimento são descritos. (C) Aqui é mostrada uma foto do Fly Hotel. Os tubos de vidro são preenchidos com comida de mosca e selados em uma extremidade. As moscas individuais são carregadas em tubos individuais. Depois que o DNA extraído do led médio de moscas individuais é testado, as moscas apropriadas são retiradas do hotel de moscas e as linhas estáveis são estabelecidas. (D) Abordagem para configurar cruzamentos pós-triagem de moscas (mostrados aqui em azul) que passaram no teste de triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens representativas da proteína PERIOD-mNeonGreen nos neurônios-relógio. Imagens representativas de moscas men-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdTomato arrastadas para ciclos Claro-Escuro. ZT refere-se ao tempo de Zeitgeber e ZT0 refere-se ao tempo de luzes acesas e ZT12 refere-se ao tempo de luzes apagadas. O envelope nuclear do neurônio do relógio é marcado com tdTomato, mostrado aqui em vermelho, e a proteína PERIOD é marcada com mNeonGreen e mostrada em verde. A proteína PERIOD é organizada em focos nucleares discretos ao longo dos períodos do final da noite e início da manhã. Barras de escala, 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de sequências de sgRNA para marcar o gene endógeno do período no terminal C e primers usados para realizar a triagem de PCR de perna única.

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.