Artigo de método

Chip de detecção modificado com grafeno de alto desempenho para detecção de SARS-CoV-2

DOI:

10.3791/64730

⸱

5 de maio de 2023

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1RFIC Bio Centre, Kwangwoon University, 2Department of Electronics Engineering, Kwangwoon University, 3NDAC Centre, Kwangwoon University, 4Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 5Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 6Department of Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 7NanoBioTech Laboratory, Department of Environmental Engineering, Florida Polytechnic University, 8School of Engineering, University of Petroleum and Energy Studies (UPES)

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve a fabricação de protótipos de biossensores de baixo custo baseados em nanossistemas úteis para detectar com precisão proteínas virais (no nível Fg). Uma plataforma de sensor tão pequena permite aplicativos de ponto de atendimento que podem ser integrados à Internet das Coisas Médicas (IoMT) para atender aos objetivos de telemedicina.

Resumo

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Este modelo de protótipo de detecção envolve o desenvolvimento de um chip de detecção capacitivo interdigital duplo (DIDC) reutilizável e envidraçado com óxido de grafeno duplo (GrO) para detectar o vírus coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) de forma específica e rápida. O DIDC fabricado compreende um substrato de vidro contendo Ti/Pt envidraçado com óxido de grafeno (GrO), que é posteriormente modificado quimicamente com EDC-NHS para imobilizar anticorpos (Abs) hostis ao SARS-CoV-2 com base na proteína spike (S1) do vírus. Os resultados de investigações perspicazes mostraram que o GrO forneceu uma superfície projetada ideal para a imobilização de Ab e aumentou a capacitância para permitir maior sensibilidade e baixos limites de detecção. Esses elementos sintonizáveis ajudaram a atingir uma ampla faixa de detecção (1,0 mg / mL a 1,0 fg / mL), um limite mínimo de detecção de 1 fg / mL, alta capacidade de resposta e boa linearidade de 18,56 nF / g e um tempo de reação rápido de 3 s. Além disso, em termos de desenvolvimento de estruturas de teste de ponto de atendimento (POC) financeiramente viáveis, a reutilização do biochip GrO-DIDC neste estudo é boa. Significativamente, o biochip é específico contra antígenos transmitidos pelo sangue e é estável por até 10 dias a 5 °C. Devido à sua compactação, este biossensor reduzido tem potencial para diagnósticos POC de infecção por COVID-19. Este sistema também pode detectar outras doenças virais graves, embora uma etapa de aprovação utilizando outros exemplos de vírus esteja em desenvolvimento.

Introdução

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Uma pandemia viral causada por um novo beta coronavírus1 (ou seja, 2019-nCoV), que mais tarde foi denominado coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2)2 (doravante predominantemente referido como vírus), envolvendo um cluster pneumônico e desconforto respiratório agudo grave, surgiu na cidade de Wuhan, China, no final de 20193. Devido à sua rápida transmissão mundial de humano para humano, alta taxa de infecção, alta taxa de mortalidade e efeitos adversos graves com risco de vida4, durante a pandemia, a pesquisa em virologia5 evoluiu rapidamente para identificar a organização e estrutura genômica do vírus 5,6. Os sintomas da COVID-19 7,8 incluem febre alta, tosse seca e dor generalizada9. É importante ressaltar que diferentes sorotipos do vírus levam a diferentes gravidades da doença10. Além disso, portadores assintomáticos podem potencialmente espalhar o vírus. Normalmente, ao microscópio, as partículas do vírus COVID-19 apresentam projeções semelhantes a tacos formadas por proteínas spike11. Portanto, para controlar a disseminação desse novo patógeno, a detecção de casos deve ser oportuna e eficiente. Assim, a detecção ultrassensível, rápida e seletiva do vírus nos estágios iniciais da infecção viral tornou-se crucial 2,11. O distanciamento social/físico é necessário para evitar a transmissão12 do vírus. As agências de saúde estão enfatizando o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico inteligentes e nanossistemas13. De fato, conforme sugerido pelas agências de saúde, a testagem direcionada e em massa14,15 é necessária e ainda está em demanda.

Em princípio, os métodos de diagnóstico biológico em andamento, como a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR), são os melhores meios para a identificação em massa do SARS-CoV-2, como acontece com o coronavírus relacionado à síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV)16 e SARS-CoV-117. Nesse contexto, a identificação padrão atual da contaminação por SARS-CoV-2 depende do aprimoramento das características específicas da infecção18,19. Além disso, deve-se levar em consideração a variação da infecção por SARS-CoV-2 de acordo com a área, idade, raça e sexo. Com o objetivo final de salvar vidas, é crucial construir ferramentas de diagnóstico rápidas para uso no ponto de atendimento (POC)20,21.

Nesse contexto, estratégias regulares como hibridização in situ fluorescente (FISH), exame imunoenzimático de proteínas (ELISA), métodos baseados em microesferas, testes eletroquímicos e ressonância magnética, PET e NIRFOI22 têm baixa sensibilidade a baixos níveis de vírus, baixa seletividade e baixa capacidade de reutilização; Além disso, esses procedimentos apresentam desvantagens, incluindo sistemas de diagnóstico biossensoriais caros, reagentes não reutilizáveis e a necessidade de uma força de trabalho altamente qualificada23. Portanto, essas técnicas perspicazes não podem ser vistas como métodos POC rápidos, razoáveis, excepcionalmente específicos ou sensíveis24,25. É importante notar que existem diferentes tipos de biossensores baseados em DNA e imunizante que utilizam técnicas compostas, capacitivas e elétricas 18,26,27,28. Por exemplo, biossensores elétricos de DNA, que têm alta capacidade de resposta, podem ser reduzidos de forma simples e são ajustáveis29,30, foram produzidos para a detecção de Ebola31, Zika, MERS-CoV e SARS-CoV 32,33,34. Da mesma forma, um biossensor semicondutor de impacto de campo (FET) para detectar a proteína spike do vírus utilizando certos anticorpos (monoclonais) imobilizados em dispositivos envidraçados com grafeno foi efetivamente criado35,36. No entanto, essa nova estratégia é menos sensível do que a RT-PCR. Além disso, mais recentemente, foi desenvolvida uma estrutura de detecção baseada em terminal 3D coberta com óxido de grafeno (GrO) com nanopartículas de jato de aerossol para o vírus, que tem um limite baixo de identificação (2,8 × 10−15 M); em qualquer caso, a estrutura complexa de biossensorproposta 35 foi testada em relação ao uso de POC e comparada com outras estratégias de biossensores existentes que são utilizadas para a detecção do vírus 35,37,38.

Neste estudo, projetamos e fabricamos um biossensor DIDC baseado em GrO em escala reduzida e reutilizável para identificar a proteína spike do vírus sem as limitações descritas acima para outros biossensores. Este biossensor permite a detecção no nível do femtograma (fg) dentro de 3 s 18,27 do tempo de resposta. Para realizar esta pesquisa, os nanoflocos de GrO foram escolhidos para melhor capacidade de resposta e seletividade, o que significa que podem ser detectadas baixas concentrações da proteína do antígeno do vírus de swabs orofaríngeos ou nasofaríngeos. O GrO é um material apropriado, sinteticamente confiável, consistente e condutor que pode ser utilizado de forma benéfica para aplicações de biossensoriamento 2,39,40,41. Além disso, foi utilizada uma abordagem de hibridização livre de marcadores de anticorpos IgG monoclonais, com foco na proteína S1 spike do vírus. O biossensor SARS-CoV-2-GrO-DIDC fabricado é reutilizável após tratamento avançado e limpeza com solução de piranha. Este biossensor ultrarrápido, sensível, seletivo, sem rótulos e reutilizável pode ser utilizado para biossensores de amostras clínicas e aplicações de saúde personalizadas 26,42,43,44.

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Protocolo

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1. Limpeza do chip de detecção DIDC

  1. No início do experimento, limpar a superfície do chip DIDC26 com solução de piranha (H2SO4:H2O2na proporção de 3:1) e colocá-la na placa de aquecimento a 80 °C por 15 min. Em seguida, enxágue a superfície do sensor com água destilada gota a gota usando uma pipeta para remover completamente os reagentes de limpeza. Para garantir a remoção completa do reagente, enxágue a superfície com quatro a cinco gotas de álcool etílico.
    NOTA: O chip DIDC foi fabricado após um relatório publicado anteriormente26.
  2. Em seguida, seque a superfície do sensor à temperatura ambiente para a remoção completa dos reagentes para obter uma superfície de sensor hidrofílica. Este chip pode ser usado para fabricação adicional da camada de óxido de grafeno no chip (etapa 2).
  3. Cubra as almofadas limpas do eletrodo do chip do sensor com fita de poliimida.

2. Fabricação da fina camada de óxido de grafeno no chip de detecção DIDC

  1. Coloque o chip no centro da máquina de revestimento giratório na posição horizontal e adicione 4 μL de uma solução aquosa de óxido de grafeno de camada única (GO) disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) na superfície do chip. Em seguida, feche a câmara de revestimento giratório e execute por 2 min a 1.300 rpm.
  2. Para o recozimento do chip GO fabricado, mantenha o chip na placa quente horizontalmente por 40 min a 80 °C.

3. Reticulação e funcionalização do chip de detecção DIDC envidraçado em GO

  1. Realize a reticulação do cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida (EDC) e NHydroxysuccinimida (NHS) com o chip GO de filme fino.
    1. Adicione 4 μL (0,4 M e 0,1 M, respectivamente) de EDC-NHS (ver Tabela de Materiais) ao chip GO de filme fino para gerar a conjugação covalente de grupos amina e carboxílicos por meio da formação de ligações amida26.

4. Preparação e imobilização de anticorpos no chip para detecção de proteínas

  1. Para ligar o chip GO-DIDC funcionalizado ao anticorpo, dissolva o Abs anti-SARS-CoV-2 disponível comercialmente (reproduzido pela proteína anti-S1 mAb de coelho, consulte a Tabela de Materiais) usando o tampão de diluição (0,01 M PBS contendo 0,1% BSA [albumina de soro bovino] e 0,86% NaCl).
    1. A 1 μg de anticorpo purificado, adicione 1 ml de PBS diluído. Em seguida, lance 4 μL da solução de anticorpos no chip GO-DIDC ativado reticulado. Deixe o chip na câmara fechada por 2 h para ligar o Abs à superfície do chip funcionalizado à temperatura ambiente.
      NOTA: A região Fab do Abs geralmente consiste em abundantes grupos reativos amina e carboxílicos devido à sua natureza polar26; portanto, a imobilização específica subsequente leva a uma orientação específica de Ab covalente robusta "cauda".
  2. Uma vez feita a imobilização do anticorpo na superfície do sensor, coloque 4 μL de albumina de soro bovino (BSA) no chip para bloquear os locais não específicos do chip de detecção imunocapacitiva. Coloque o cavaco horizontalmente na câmara fechada por 20 min em temperatura ambiente.
  3. Lave o chip sensor imunocapacitivo com água DI e continue secando à temperatura ambiente.
    NOTA: Após a secagem, o imunossensor capacitivo baseado em DIDC (SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDCs) está pronto para realizar a detecção serial do antígeno spike do vírus.
  4. Para uma maior detecção da proteína spike do vírus, prepare diferentes concentrações de 1,0 mg a 1,0 fg para obter um amplo limite de detecção.

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Resultados

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Aqui, é apresentado um protocolo para detectar a proteína S1 do vírus SARS-CoV-2 usando um chip de detecção capacitivo duplo interdigitado (DIDC) envidraçado com óxido de grafeno. A Figura 1 mostra uma representação esquemática (fabricação com o layout do circuito) do chip de detecção capacitivo duplo interdigitado modificado com óxido de grafeno (DIDC) extremamente sensível e reciclável. O processo de fabricação passo a passo detalhado é mostrado na Figura 2. <...

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Discussão

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Para criar um biossensor produtivo baseado em chip DIDC, a distribuição de carga, a condutividade e a constante dielétrica do DIDC são extremamente importantes. Significativamente, as melhorias nesses limites de detecção estão relacionadas à reatância capacitiva do DIDC 18,26,27. Neste estudo, foi fabricado um imunossensor de capacitância hostil ao vírus Abs e funcionalizado pelo acoplamento EDC...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado até certo ponto pelo Programa de Pesquisa em Ciências Básicas por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) patrocinado pelo Ministério da Educação sob a Concessão 2018R1D1A1A09083353 e Concessão 2018R1A6A1A03025242, um pouco pela GCS Group Association Ltd., e pela Escola de Pós-Graduação do Ministério do Meio Ambiente da Coreia (MOE) investiu enorme energia no Projeto Integrado de Prevenção e Controle da Poluição e uma Bolsa de Pesquisa da Universidade de Kwangwoon em 2022.

E.M. gostaria de agradecer o apoio do Instituto Nacional de Imagens Biomédicas e Bioengenharia (5T32EB009035).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Amilóide β 1-42 ProteínaMerck (Sigma-Aldrich)107761-42-2
anti-SARS-CoV-2 Spike (S1) anticorpo monoclonal IgG SinoBiological40150-R007
EDC [N- (3-dimetilaminopropil) -N′-cloridrato de etilcarbodiimida]Thermo Fisher ScientificA35391
Álcool etílico (C2H5OH)Peróxido de hidrogênio Sigma-Aldrich
(H2O2)
Fitapoliimida
NHS (NHydroxysuccinimida, 98+%; C4H5NO3)Thermo Fisher ScientificA39269
PBS Antígeno
específico da próstata Sigma-AldrichP3338-25UG
SARS-CoV-2 Spike S1-His proteína recombinanteSinoBiological40591-V08H
Óxido de Grafeno de camada única GrapheneSupermarket
Spin Coater Revestidorde alta precisão (Sistema de Revestimento de Spin)ACE-200:
Ácido sulfúrico (H2SO4)
de de fita Kapton

Referências

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