Artigo de método

Determinação da absorção, translocação e distribuição do imidaclopride em trigo

DOI:

10.3791/64741

⸱

28 de abril de 2023

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Agricultural Environment in Universities of Shandong, College of Resources and Environment, Shandong Agricultural University, 2College of Water Conservancy and Civil Engineering, Shandong Agricultural University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Apresenta-se um protocolo para a determinação da absorção, translocação e distribuição do imidaclopride em trigo sob condições hidropônicas usando cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS-MS). Os resultados mostraram que o imidaclopride pode ser absorvido pelo trigo, e o imidaclopride foi detectado tanto nas raízes quanto nas folhas do trigo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os neonicotinóides, uma classe de inseticidas, são amplamente utilizados devido aos seus novos modos de ação, alta atividade inseticida e forte absorção de raízes. O imidaclopride, o inseticida mais utilizado em todo o mundo, é um neonicotinóide representativo de primeira geração e é usado no controle de pragas de culturas, hortaliças e árvores frutíferas. Com uma aplicação tão ampla do imidaclopride, seu resíduo nas lavouras tem atraído cada vez mais escrutínio. No presente estudo, 15 mudas de trigo foram colocadas em meio de cultura contendo 0,5 mg/L ou 5 mg/L de imidaclopride para hidrocultivo. O teor de imidaclopride nas raízes e folhas do trigo foi determinado após 1 dia, 2 dias e 3 dias de hidrocultivo para explorar a migração e distribuição do imidaclopride no trigo. Os resultados mostraram que o imidaclopride foi detectado tanto nas raízes quanto nas folhas da planta de trigo, e o teor de imidaclopride nas raízes foi maior do que nas folhas. Além disso, a concentração de imidaclopride no trigo aumentou com o aumento do tempo de exposição. Após 3 dias de exposição, as raízes e folhas do trigo do grupo de tratamento 0,5 mg/L continham 4,55 mg/kg ± 1,45 mg/kg e 1,30 mg/kg ± 0,08 mg/kg de imidacloprido, respectivamente, enquanto as raízes e folhas do grupo de tratamento 5 mg/L continham 42,5 mg/kg ± 0,62 mg/kg e 8,71 mg/kg ± 0,14 mg/kg de imidacloprido, respectivamente. Os resultados do presente estudo permitem um melhor entendimento dos resíduos de agrotóxicos nas culturas e fornecem uma referência de dados para a avaliação de risco ambiental de agrotóxicos.

Introdução

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Na agronomia atual, o uso de agrotóxicos é essencial para aumentar a produtividade das culturas. Os inseticidas neonicotinóides alteram o equilíbrio do potencial de membrana pelo controle dos receptores nicotínicos de acetilcolina no sistema nervoso dos insetos, inibindo a condução normal do sistema nervoso central dos insetos, levando à paralisia e morte dos insetos1. Os neonicotinóides, comparados aos inseticidas tradicionais, apresentam vantagens como novos modos de ação, alta atividade inseticida e forte absorção radicular, tornando-os altamente bem-sucedidos no mercado de agrotóxicos 2,3. O volume de vendas de neonicotinóides representou 27% do mercado mundial de pesticidas em 2014. A taxa média de crescimento anual dos neonicotinóides foi de 11,4% de 2005 a 2010, dos quais cerca de 7% foram registrados na China 4,5,6. Do final de 2016 ao primeiro semestre de 2017, as vendas de pesticidas na China começaram a se recuperar após queda, e os preços dos pesticidas continuaram a subir, entre os quais os inseticidas neonicotinoides apresentaram um aumento significativo de preços7. Até o momento, três gerações de inseticidas neonicotinóides foram desenvolvidas, cada uma contendo os grupos nicotina cloreto de piridina, tiazolilo e tetraidrofurano, respectivamente8.

O imidaclopride representa a primeira geração de inseticidas neonicotinóides, cuja fórmula molecular é C9H10ClN5O2, e é um cristal incolor. O imidaclopride é usado principalmente no controle de pragas, como pulgões, cigarrinhas, larvas e tripes9 e pode ser aplicado em culturas como arroz, trigo, milho, algodão e hortaliças, como batata, além de árvores frutíferas. Devido à aplicação de pesticidas a longo prazo, substancial e contínua, tanto os insetos benéficos quanto os inimigos naturais das pragas foram rapidamente reduzidos, e algumas pragas agrícolas tornaram-se resistentes aos pesticidas, resultando em um círculo vicioso de aplicação contínua e crescente de pesticidas10. Além disso, a aplicação extensiva de pesticidas tem levado à deterioração da qualidade do solo, resíduos persistentes de pesticidas em produtos agrícolas e outros problemas ecológicos, que não só causam danos significativos ao ambiente ecológico agrícola11 mas também representam uma séria ameaça à saúde humana12. A pulverização de pesticidas afeta severamente o crescimento e a qualidade dos micróbios do solo e dos animais do solo13. O uso excessivo ou irracional de agrotóxicos tem causado riscos significativos à segurança do solo e da água, ao meio ambiente, aos animais e plantas e até mesmo à vida humana14. Nos últimos anos, o problema do excesso de resíduos de agrotóxicos nas lavouras tornou-se mais grave com a aplicação extensiva de agrotóxicos. Quando o imidaclopride foi usado para aumentar a produtividade de hortaliças, a taxa de absorção de imidaclopride nas hortaliças aumentou com o aumento da quantidade e do resíduo de imidaclopride15. Como uma grande cultura alimentar, tanto a produção quanto a segurança do trigo são críticas. Portanto, as políticas de resíduos e distribuição de agrotóxicos utilizados para o trigo precisam ser esclarecidas.

Nos últimos anos, muitos métodos foram desenvolvidos para extrair resíduos de imidaclopride da água, solo e plantas. O método QuEChERS (rápido, fácil, barato, eficaz, robusto e seguro) é um novo método que combina tecnologia de microextração em fase sólida e tecnologia de extração em fase sólida dispersa e envolve o uso de acetonitrila como solvente de extração e a remoção de impurezas mistas e água na amostra usando NaCl e MgSO4 anidro, respectivamente16. O método QuEChERS requer vidraria mínima e possui etapas experimentais simples, tornando-se um dos métodos de extração de pesticidas mais populares17. Para a detecção de imidaclopride, um limite de detecção tão baixo quanto 1 × 10−9 g18 foi alcançado com cromatografia líquida (LC), e 1 × 10−11 g 19 foi alcançado com cromatografia gasosa (GC). Devido à sua alta resolução e sensibilidade, LC-MS e GC-MS têm mostrado limites de detecção de imidaclopride ainda mais baixos, de 1 × 10-13 a 1 × 10-14 g 20,21; Estas técnicas são, portanto, adequadas para a análise de resíduos de imidaclopride traço.

No presente estudo, o imidaclopride foi escolhido como poluente alvo, e o trigo foi selecionado como cultura teste para estudar a distribuição de resíduos de imidaclopride no trigo. Este protocolo detalha um método para a análise abrangente do enriquecimento e transferência do pesticida imidaclopride em trigo, explorando a absorção e armazenamento de imidaclopride em diferentes partes de plantas de trigo cultivadas sob condições hidropônicas. O presente estudo tem como objetivo fornecer uma base teórica para a avaliação de risco de resíduos de agrotóxicos em trigo, orientar a aplicação racional de agrotóxicos nas atividades de produção agrícola para reduzir resíduos de agrotóxicos e melhorar a segurança da produção agrícola.

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Protocolo

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1. Germinação de sementes de trigo

  1. Selecione 1.000 sementes de trigo (Jimai 20) com grânulos completos, embriões intactos e tamanho uniforme (comprimento: 6 mm ± 0,5 mm).
  2. Transferir 333,3 mL de solução 30% H 2 O2 para um balão volumétrico de 1 L e diluir com água deionizada para preparar 1 L de solução 10% H 2 O 2. Imergir as sementes de trigo em solução de H 2 O2a 10% por 15 min para desinfetar a superfície da semente (Figura 1).
  3. Enxágue as sementes de trigo 5x com água corrente estéril por 10 s de cada vez.
  4. Espalhe as sementes de trigo uniformemente com os embriões apontados para cima em uma placa de Petri de vidro contendo papel de filtro estéril úmido (Figura 2). Coloque a placa de Petri em uma incubadora artificial a 30 °C e 80% de umidade relativa. Cultivar as sementes de trigo no escuro por 3 dias até germinar e criar raízes.

figure-protocol-1
Figura 1: Desinfecção das sementes de trigo. As sementes de trigo foram embebidas em solução de H 2 O2a10 % (em béquer) por 15 min para desinfecção da superfície das sementes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Germinação das sementes de trigo. As sementes de trigo foram distribuídas uniformemente em uma placa de Petri de vidro contendo papel de filtro estéril úmido. A placa de Petri foi colocada em estufa artificial para germinar as sementes de trigo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Cultivo de mudas de trigo

  1. Dissolver 551 mg da mistura de sal basal de Hoagland em 1 L de água deionizada para preparar 1/2 solução nutritiva Hoagland (contendo 0,75 mmol/L K2SO 4, 0,1 mmol/L KCl, 0,6 mmol/L MgSO 4, 4,0 × 10−2 mmol/L FeEDTA, 1,0 × 10−3 mmol/L H 3 BO3, 1,0 × 10−3 mmol/L MnSO4, 1,0 × 10−3 mmol/L ZnSO 4, 1,0 × 10−4 mmol/L CuSO 4 e 5,0 × 10−6 mmol/L Na2 MoO 4).
  2. Após a germinação das sementes de trigo (etapa 1.4), colocar 15 plântulas de trigo em equipamento hidropônico (ver Tabela de Materiais) contendo 100 mL de solução nutritiva Hoagland 1/2 para hidroponia (Figura 3). Colocar todo o aparelho hidropónico numa incubadora de clima artificial (ver Tabela de Materiais) e incubar durante 7 dias a 25 °C e 80% de humidade relativa com fotoperíodo de 16 h claro/8 h escuro.

figure-protocol-3
Figura 3: Cultivo hidropônico das mudas de trigo. As mudas de trigo foram cultivadas hidroponicamente por 0 dias, 3 dias e 7 dias em 100 mL de solução nutritiva Hoagland 1/2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Experimento de exposição das plantas de trigo à solução de imidaclopride

  1. Após um período hidropônico de 7 dias, transplante as plantas de trigo em solução nutritiva de 1/2 Hoagland contendo 0,5 mg/L ou 5 mg/L de imidaclopride para conduzir os experimentos de exposição ao imidacloprido. Cultivar 15 plantas de trigo em cada dispositivo hidropônico. Instalar 15 dispositivos hidropónicos para cada grupo de concentração de imidaclopride para garantir a colheita de amostras adequadas durante a amostragem.
  2. Colocar todo o equipamento hidropônico em uma incubadora de clima artificial por 3 dias a 25 °C e 80% de umidade relativa com fotoperíodo de 16 h claro/8 h escuro.
  3. Durante todo o período de exposição, coletar raízes de trigo (0,2 g por planta de trigo) e folhas (0,5 g por planta de trigo) diariamente. Integrar as amostras de trigo de cada quinto dispositivo hidropónico como um grupo paralelo e determinar o teor de imidaclopride das amostras.

4. Processo de extracção do imidaclopride do trigo

  1. Extração de imidaclopride de raízes de trigo
    1. Para evitar erros experimentais, lavar as raízes de trigo 4x com água corrente estéril por 10 s cada vez para remover qualquer imidaclopride adsorvido na superfície radicular.
    2. Triture as raízes de trigo em pedaços de aproximadamente 1 cm com tesoura (Figura 4). Pesar 10,00 g das raízes de trigo trituradas e colocar em um tubo de centrífuga de 50 mL.
    3. Adicionar 10 mL de acetonitrila ao tubo da centrífuga e agitar o tubo em um vórtice por 1 min. Em seguida, adicionar 4 g de MgSOanidro 4 e 1,5 g de NaCl ao tubo da centrífuga e vórtex o tubo imediatamente por 30 s. Centrifugar o tubo por 5 min a 6.000 x g.
    4. Aspirar o sobrenadante com uma seringa descartável e passá-lo através de um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,22 μm) para obter a amostra.
  2. Extração de imidaclopride de folhas de trigo (Figura 5)
    1. Triture as folhas de trigo fresco em pedaços de aproximadamente 1 cm com tesoura (Figura 4). Pesar 10,00 g das folhas de trigo desfiadas e colocar em um tubo de centrífuga de 50 mL.
    2. Adicione 10 mL de acetonitrila ao tubo da centrífuga e vomite o tubo em um vórtice por 1 min.
    3. Adicionar 4 g de MgSO4 anidro e 1,5 g de NaCl ao tubo da centrífuga e agitar o tubo imediatamente por 30 s.
    4. Centrifugar o tubo por 5 min a 6.000 x g.
    5. Após a centrifugação, adicionar 2 mL do sobrenadante a um tubo centrífugo de 5 mL contendo 50 mg de negro de fumo grafitizado (GCB) e 150 mg de MgSO4 anidro (para remover pigmento e umidade da amostra) e agitar o tubo centrífugo por 30 s (Figura 6). Centrifugar o tubo por 5 min a 6.000 x g.
    6. Aspirar o sobrenadante com uma seringa descartável e passá-lo através de um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,22 μm) para obter a amostra.

figure-protocol-4
Figura 4: Raízes e folhas de trigo trituradas. Raízes e folhas frescas de trigo foram trituradas com tesoura em pedaços de aproximadamente 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-5
Figura 5: Extração de imidaclopride nas folhas de trigo. O imidaclopride nas amostras foi extraído usando o método QuEChERS (passos 4.2.1-4.2.4 do protocolo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-6
Figura 6: Purificação do imidaclopride nas folhas de trigo. O descontaminante utilizado foi 50 mg GCB + 150 mg MgSO4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Quantificação do imidaclopride

  1. Quantificar o imidaclopride na amostra utilizando cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS-MS), com base numa curva padrão (y = 696,61x + 56,411, R=1) obtida a partir de concentrações de 0,2-250 μg/L de imidacloprido. (Figura 7). O espectrômetro de massas foi equipado com uma coluna C18 (100 mm x 2,1 mm, 3 μm) e uma fonte de ionização por eletrospray (ESI+). O programa de eluição e os parâmetros da fonte iônica são mostrados na Tabela 1.

figure-protocol-7
Figura 7: Cromatograma e espectrograma de massas do imidaclopride nas folhas de trigo. O painel superior mostra um cromatograma de imidaclopride (tempo de retenção = 0,93 min). O painel inferior mostra o espectrograma de massas do imidaclopride a 0,93 min, mostrando a intensidade de resposta da produção (m/z = 208,8) do imidaclopride. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Temperatura da coluna40 °C
Solvente A99,9% água/0,1% ácido fórmico (v/v)
Solvente BAcetonitrilo
Programa de eluição0–0,5 min, A = 20%
0,5–2 min, A = 20%–50%
2–3 min, A = 50%
3–3,1 min, A = 50%–20%
3,1–5 min, A=20%
Vazão (mL/min)0.3
Volume de injeção (μL)5
Temperatura capilar (°C)330
Temperatura do vaporizador (°C)350
Vazão de gás da bainha (Arb)40
Caudal de gás auxiliar (Arb)20
Tensão de pulverização (V)3900
Pressão do gás de colisão (mTorr)1.5
Íon precursor256.1
Íon do produto/Energia de colisão (eV)208.8/16

Tabela 1: Programa de eluição e parâmetros da fonte iônica do método de cromatografia líquida-espectrometria de massas.

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Resultados

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O limite de detecção do instrumento (LOD) de imidaclopride foi de 5,76 × 10−14 g, e o LOD do método de imidaclopride na raiz ou folha de trigo foi de 0,01 μg/kg; nenhum efeito de matriz foi observado. Os rendimentos de recuperação do imidaclopride em trigo são mostrados na Tabela 2. Os rendimentos de recuperação do imidaclopride das raízes de trigo expostas a concentrações de imidaclopride de 0,5 mg/L e 5 mg/L foram de 94,0%-97,6% e 98,8%-99,2%, respectivamente; Os coeficientes de variação for...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos últimos anos, métodos de pré-tratamento e detecção de resíduos do pesticida imidaclopride têm sido frequentemente relatados. Badawy et al.23 utilizaram cromatografia líquida de alta eficiência para determinar o teor de imidaclopride em frutos de tomate cultivados em casa de vegetação e relataram boa linearidade para imidaclopride na faixa de 0,0125-0,15 μg/mL. Zhai et al.24 utilizaram LC-MS-MS para estudar o resíduo de imidaclopride em cebolinha chinesa. No presente est...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito. Este trabalho não foi publicado anteriormente, nem está sendo considerado por qualquer outra revista revisada por pares.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 42277039).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcetonitrilaSigma-Aldrich (Xangai) Trading Co. Ltd.01-06-1995Adequado para HPLC, grau de gradiente, >99,9%
Balança analíticaSartorius Lab Instruments Co.Ltd.GL124-1SCN
Incubadora de clima artificial   Fornecedor verificado - Shanghai Badian Instrument Equipment Co., Ltd.HK320
CentrífugaEppendorf China Co., Ltd.Centrifuge5804
Seringa descartávelSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.Z116866Capacidade 5 mL, graduado 0,2 mL,
ácido fórmicoSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.Y0001970Padrão de referência da farmacopeia europeia
Negro de fumo grafitizado (GCB)Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.V90005845 μ m
H2O2Sigma-Aldrich (Xangai) Trading Co.Ltd.3164230% (p/p)
Hoagland' s Mistura de Sal BasalShanghai Yu Bo Biotech Co., Ltd.NS1011Anidro, reagente grau
Equipamento hidropônicoJiangsu Rongcheng Desenvolvimento Agrícola Ciência e Tecnologia Co.Ltd.
Coluna Hypersil BDS C18Thermo Fisher Scientific (China) Co. Ltd.28103-102130
ImidaclopridSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.Y0002028Padrão de referência da farmacopeia europeia
MgSO4Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.208094Anidro, grau reagente, >97%
NaClSigma-Aldrich (Xangai) Trading Co.Ltd.S9888Grau de reagente, medidor de 99%
Thunder Magnetic Instrument FactoryPHSJ-3F
Phytotron boxHarbin Donglian Electronic Technology Co. Ltd.HPG-280B
PipetasEppendorf China Co. Ltd.Pesquisa mais
filtro de seringaSigma-Aldrich (Xangai) Trading Co.Ltd.SLGV033NNylon, 0.22 µ m tamanho dos poros, 33 mm, não estéril
Cromatografia líquida de ultra desempenho em tandem espectrometria de massa tripla quadrupoloThermo Fisher Scientific (China) Co. Ltd.UltiMate 3000
TSQ Quantum Access MAX
Mixer de vórticeShanghai Yetuo Technology Co., Ltd.Vortex-2
Semente de trigoLuKe indústriade sementes Jimai 20
não estéril SDZ04BD pH Shanghai

Referências

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