Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos intersticiais (MIs) pulmonares e sua transferência adotiva após estimulação com IL-33 dos alvéolos pulmonares em modelo murino, o que pode facilitar o estudo in vivo da fibrose pulmonar idiopática (FPI).
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Artigo de método
Transferência Adotiva de Macrófagos Estimulados por IL-33 em Modelos de Camundongos Induzidos por Bleomicina para Estudar seu Efeito na Fibrose Pulmonar Idiopática In Vivo
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Resumo
Resumo
A resposta inflamatória causada pela lesão pulmonar precoce é uma das causas importantes do desenvolvimento da fibrose pulmonar idiopática (FPI), que é acompanhada pela ativação de células inflamatórias, como macrófagos e neutrófilos, bem como pela liberação de fatores inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-1β e IL-6. Sabe-se que a inflamação precoce causada por macrófagos intersticiais (MIs) pulmonares ativados em resposta à estimulação com IL-33 desempenha um papel vital no processo patológico da FPI. Este protocolo descreve a transferência adotiva de MIs estimuladas por IL-33 para os pulmões de camundongos para estudar o desenvolvimento de FPI. Envolve o isolamento e a cultura de MIs primárias de pulmões de camundongos hospedeiros, seguida pela transferência adotiva de MIs estimuladas para os alvéolos de camundongos receptores de FPI induzidos por bleomicina (BLM) (que foram previamente depletados de macrófagos alveolares pelo tratamento com lipossomas clodronatos) e a avaliação patológica desses camundongos. Os resultados representativos mostram que a transferência adotiva de macrófagos estimulados por IL-33 agrava a fibrose pulmonar em camundongos, sugerindo que o estabelecimento do experimento de transferência adotiva de macrófagos é um bom meio técnico para estudar a patologia da FPI.
Introdução
A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é uma doença inflamatória pulmonar difusa causada por váriosfatores1. No microambiente de citocinas da resposta imune Th1 e Th2, os macrófagos podem ser polarizados em macrófagos classicamente ativados (M1) e, alternativamente, macrófagos ativados (M2). Os lipopolissacarídeos (LPS) ou a citocina IFN-γ induzem macrófagos M1 a polarizar e produzir citocinas pró-inflamatórias, incluindo iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Em contraste, as citocinas tipo II IL-4 e IL-13 conduzem a polarização dos macrófagos M2, que podem produzir diferentes fatores promotores de crescimento de fibroblastos, como TGF-β e PDGF, que promovem fibrose pulmonar2. O processo patológico da FPI é acompanhado por ativação e infiltração de macrófagos. A FPI medeia o reparo da lesão, inflamação e fibrose por meio da liberação de citocinas3. Como apenas opções terapêuticas limitadas estão disponíveis, explorar os mecanismos patológicos moleculares da FPI tem grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento da FPI. Estudos prévios realizados por nosso grupo e por outros pesquisadores 4,5 confirmaram o aumento da liberação de IL-33 em pacientes com FPI e em modelos de camundongos com FPI induzida por bleomicina (BLM). A IL-33 é liberada pelas células epiteliais e endoteliais durante a fibrose e está envolvida na ativação de macrófagos, resultando na proliferação anormal de fibroblastos, infiltração leucocitária e eventual perda da função pulmonar5. O protocolo atual descreve a transferência adotiva de macrófagos intersticiais (MIs) estimulados por IL-33 para os alvéolos como um meio de estudar o desenvolvimento de FPI em modelos de camundongos. Aqui, as MIs foram isoladas do tecido pulmonar de camundongos hospedeiros, cultivadas in vitro, estimuladas com IL-33 por 24 h e, em seguida, transferidas adotivamente para os alvéolos de camundongos receptores por injeção traqueal. A coleta direta de macrófagos de camundongos estimulados e sua transferência adotiva para os alvéolos receptores agravou o grau de fibrose pulmonar e pode ilustrar mais claramente a influência dos fatores estimulantes na fibrose em comparação com os estudos anteriores6. A técnica descrita neste trabalho pode permitir que os pesquisadores explorem a função de macrófagos estimulados por potenciais citocinas no desenvolvimento da FPI.
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal Experimental da Universidade de Jiangnan (JN No. 20211130m1720615[501]).
NOTA: No total, 10 camundongos C57BL/6 machos com idade entre 6-8 semanas e pesando 20-25 g foram usados neste estudo. Os três grupos experimentais do estudo incluíram três camundongos receptores cada, e um camundongo hospedeiro foi usado para o isolamento IM.
1. Depleção de macrófagos pulmonares de camundongos
- Retire o frasco de lipossomas clodronato (ver Tabela de Materiais) da geladeira com 30 minutos de antecedência, aqueça-o à temperatura ambiente e inverta-o várias vezes para garantir uma mistura uniforme.
NOTA: Os lipossomas clodronato encapsulam as moléculas hidrofílicas de bifosfonato de diclorometileno. Quando esses lipossomas são consumidos pelos macrófagos, o clodronato é liberado gradativamente pela ação da fosfatase lisossômica e, consequentemente, seu acúmulo desencadeia a apoptose celular e a depleção dos macrófagos7. - Anestesiar camundongos com isoflurano a 3%. Verifique a profundidade da anestesia apertando um pé para verificar a consciência. Aplique pomada veterinária em ambos os olhos para evitar o ressecamento sob anestesia.
- Aspirar 60 μL de lipossomas clodronados usando uma pipeta com uma ponta de sucção estéril. Administre a droga gota a gota na cavidade nasal do camundongo anestesiado, de modo que, quando o camundongo inala, a droga é inalada na traqueia. Após cada gota, certifique-se de que o rato inala a droga completamente e está respirando uniformemente. Administrar lipossomas contendo PBS isoladamente como controle8 (Figura 2).
- Coloque os ratos em uma mesa de temperatura constante de 38 °C para reaquecimento para acelerar sua recuperação. Monitore os ratos até que eles acordem. Depois que os camundongos se recuperarem bem e atingirem decúbito esternal, transfira-os para a gaiola.
- Utilizar camundongos com macrófagos alveolares esgotados 2 dias após o tratamento com lipossomas clodronatos como camundongos receptores para o experimento de transferência.
NOTA: Neste estudo, a depleção de macrófagos alveolares foi confirmada pela verificação da expressão de marcadores macrofágicos conforme descrito anteriormente 8,9 após a administração de lipossomas clodronados por inalação (ver Figura 1 Suplementar).
2. Isolamento e cultura das MIs
- Anestesiar o camundongo hospedeiro com injeção intraperitoneal de Cetamina (120 mg/kg) e Xilazina (16 mg/kg). Confirme a profundidade da anestesia através da perda do reflexo de pinça do dedo. Aplique pomada veterinária em ambos os olhos para evitar o ressecamento sob anestesia. Em seguida, desinfete a pele do camundongo anestesiado com álcool a 75% e iodo. Use tesoura para cortar a pele e expor o tecido cardiopulmonar
- Aspirar 10 mL de PBS 1x em uma seringa com uma agulha de 20 G e inserir a ponta da agulha no átrio direito do mouse (Figura 3A). Cortar a veia cava inferior do camundongo com tesoura cirúrgica e, em seguida, perfundir manualmente o camundongo com PBS em uma velocidade constante (10-20 mL/min) até que o tecido pulmonar fique branco. Excisar o tecido pulmonar e transferi-lo para PBS gelado em uma placa de cultura (Figura 3B).
- Cortar o tecido pulmonar em fragmentos de aproximadamente 2 mm x 2 mm x 2 mm. Em seguida, adicionar 15 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 1% de colagenase A ao tecido pulmonar para isolar os macrófagos. Incubar a 100 rpm durante 30 min numa mesa de agitação a 37 °C.
- Aspirar a suspensão de tecido pulmonar através de uma seringa de 10 mL pelo menos 20x para torná-la o mais fina possível. Filtre esta suspensão através de um filtro de células de 40 μm. Centrifugar o filtrado a 400 x g durante 10 min e eliminar o sobrenadante.
- Lisar os glóbulos vermelhos no pellet adicionando 3 mL de tampão de lise eritrocitária (ver Tabela de Materiais) no gelo por 2-3 min.
- Após centrifugação a 150 x g por 5 min, ressuspender o pellet de células com 10 mL de DMEM (contendo 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Conte as células usando um hemocitômetro.
- Semeando as células em placas de cultura celular aderentes de 10 cm a 2 x 107 células/prato e incubar por 1 h a 37 °C e 5% CO2. Isso permite que os MIs pulmonares adiram ao prato5. Após 1 h, aspirar o sobrenadante e as células flutuantes e adicionar 10 mL de meio de cultura completo fresco (DMEM contendo SFB a 10%, penicilina a 100 U/mL e estreptomicina a 100 μg/mL). Incubar por mais de 8 h ou durante a noite.
- Determinar a pureza dos MIs obtidos usando citometria de fluxo com coloração para os marcadores F4/80 e CD11c, conforme descrito anteriormente5 (ver Figura 1 Suplementar).
3. Transferência adotiva de MIs para os alvéolos pulmonares
- Substituir o meio de cultura da placa contendo os MIs pulmonares isolados (passo 2.7) por um meio de cultura completo contendo 10 ng/mL de IL-33 para estimulação dos MIs. Incubar durante 24 h a 37 °C e 5% CO2. Use 1x PBS no lugar de IL-33 como controle.
- Dissociar as MIs pulmonares tratando-as com 1 mL de tripsina a 0,25% por 5 min. Em seguida, extinguir a digestão adicionando 3 mL de meio de cultura fresco completo e colher os macrófagos pulmonares centrifugando a suspensão celular a 150 x g e 4 °C por 5 min. Contar as células usando um hemocitômetro e ressuspender as células em PBS até uma concentração final de 5 x 105 células/50 μL.
- Anestesiar os camundongos receptores com gás isoflurano a 3%. Aguarde até que o rato fique inconsciente (como no passo 1.2) e, em seguida, fixe os membros do rato anestesiado numa placa vertical com fita adesiva. Puxe suavemente a língua do rato para um lado usando um cotonete.
- Ligue a lâmpada de intubação e brilhe-a na garganta do rato para que a traqueia possa ser vista. Verifique se a traqueia está perto da base da língua, o esôfago está perto da parte de trás do pescoço, mas a abertura do esôfago não é visível durante a operação.
- Use a lâmpada de intubação (22 G) para ajudar a intubar o mouse. Guie a cânula da agulha de longa permanência para dentro da traqueia com um fio-guia (0,4 mm de diâmetro). Remova o fio-guia e empurre a cânula para dentro da traqueia do mouse para completar a intubação.
- Depois que a cânula for observada para entrar na traqueia, injetar 50 μL da suspensão celular (contendo 5 x 105 IMs) no camundongo receptor através da traqueia.
- Coloque os ratos em uma almofada de aquecimento constante de 38°C para reaquecimento para acelerar a recuperação. Monitore os ratos até que eles acordem. Depois que eles se recuperarem bem e atingirem a decúbito esternal, transfira-os para a gaiola.
- Após 24 h, administrar bleomicina (BLM) através da traqueia (usando o procedimento nas etapas 3.3-3.5) na dose de 1,4 U/kg de peso corporal para induzir FPI. Administrar igual volume de soro fisiológico ao grupo controle.
- Após 21 dias, determinar o grau de gravidade da fibrose pulmonar para os diferentes grupos de camundongos que foram transferidos adotivamente com PBS ou suspensão IM estimulada por IL-33, avaliando a expressão de marcadores de fibrose e os escores de Ashcroft10.
- Extrair o ARN total do tecido pulmonar utilizando um reagente de extracção de ARN (ver Tabela de Materiais).
OBS: A análise quantitativa foi realizada com leitor de microplacas. Se a razão OD260/OD280 for 1,8-2,0, a pureza do RNA é alta. Todas as amostras foram armazenadas a −80°C. - Realizar PCR quantitativo de fluorescência para avaliar a expressão de actina de músculo liso α (AMS) e fibronectina utilizando primers específicos.
NOTA: Os primers utilizados para α-SMA foram 5'-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' e 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', e os primers utilizados para fibronectina foram 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' e 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.
- Extrair o ARN total do tecido pulmonar utilizando um reagente de extracção de ARN (ver Tabela de Materiais).
- Realizar imunohistoquímica conforme descrito abaixo.
- Desidratar o pulmão esquerdo, incorporá-lo e corte-o com um fatiador de parafina até uma espessura de 4 μm.
- Coloque os cortes de tecido em lâminas e asse as lâminas em um forno a 65-70 ° C por 30 min a 1 h. Descerpar as lâminas com uma porcentagem decrescente de álcool (ou seja, 100%, 95%, 90%, 80% e 70% de álcool) por 5 min.
- Manchar as lâminas em solução de corante de hematoxilina (analiticamente pura) por 5 min. Em seguida, lave as lâminas com água da torneira. Mergulhe as lâminas em álcool de ácido clorídrico a 1% por 3 s, lave a cor flutuante e mergulhe em água corrente por 5 min. As seções ficarão azuis.
- Imergir em solução de eosina por 10 s a 1 min (determine o tempo de tingimento de acordo com a cor), lavar com água da torneira e colocar em álcool a 70%, 80%, 95%, 100% e 100%, respectivamente, por 5 min cada. Em seguida, coloque as lâminas em soluções de xileno I e xileno II por 3 min. Após a secagem, observar e tirar fotos ao microscópio vertical com filme adesivo neutro selante.
- Realizar escore de Ashcroft nos cortes para indicar a gravidade da fibrose pulmonar10. Realizar análise estatística dos dados utilizando o teste t de duas amostras independentes.
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Resultados
O protocolo aqui utilizado está resumido no fluxograma da Figura 1. A inalação de lipossomas clodronados pelo nariz (Figura 2) foi utilizada para esgotar os macrófagos pulmonares de camundongos adultos C57BL/6, o que produziu um bom modelo de camundongo receptor. As MIs pulmonares foram isoladas de outro camundongo (hospedeiro) não tratado (Figura 3A,B) e cultivadas in vitro. Os macrófagos isolados foram e...
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Discussão
Este estudo fornece um método eficaz para depletar, isolar, cultivar e transferir macrófagos, o que pode ajudar no estudo dos mecanismos de fibrose pulmonar em camundongos. Existem vários métodos para a depleção de macrófagos em camundongos, como administração traqueal, injeção na veia caudal e inalação nasal11. Este estudo otimizou o método de inalação nasal, que é simples de operar e pode efetivamente esgotar macrófagospulmonares 8,9. Ap...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o Tópico Especial de Gestão de Laboratório da Universidade de Jiangnan: Construção da Biblioteca Digital Slice Baseada em Espécimes Patológicos (JDSYS202223) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81800065).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life technologies Biotecnologia,EUA | 1508012 | |
| Agulha arterial de demora | B Braun Melsingen AG,Alemanha | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson, EUA | ||
| Bleomicina | Biotang, EUA | Ab9465 | |
| Incubadora de dióxido de carbono | Thermo Forma, EUA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R & D Systems, EUA | 1124F | |
| CD11c | R & D Systems, EUA | N418 | |
| Placa de cultura de células | Thermo Forma, EUA | 174926 | |
| Lipossomas de clodronato | Lipossomas de clodronato, Holanda | CI-150-150 | |
| Colagenase A | Sigma-Aldrich, EUA | 10103578001 | |
| F4/80 | R& D Systems, EUA | 521204 | |
| Filtro de Células de Falcão | Becton, Dickinson and Company, EUA | 352340 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Life technologies, EUA | 1047571 | |
| Hematoxilina Eosina | Nanjing Jiancheng Technology, China | 06-570 | |
| LightCycler 480 Sistema de detecção de PCR | Roche, EUA | ||
| Fator recombinante murino IL-33 | Peprotech, EUA | 210-33 | |
| Microscópio Nikon | Nikon Corporation, Japão | 941185 | |
| Penicilina, estreptomicina | Tecnologias de vida, EUA | 877113 | |
| Fosfato tampão (PBS) | Tecnologia Microbiana de Guangdong Huankai, China | 1535882 | |
| tampão de lise RBC | Beyotime Biotechnology Company, China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company, China | R401-01-AA | Reagente de extração de RNA total |
| RWD Inalação Máquina de anestesia | Shenzhen Rayward Life Technology, China | R500 | |
| Parafina semiautomática fatiador | Leica, Alemanha | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japão | 410800 | |
| Tripsina 0,25% | Life Technologies, EUA | 1627172 |
Referências
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- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897(2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
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- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
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Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
