Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos intersticiais (MIs) pulmonares e sua transferência adotiva após estimulação com IL-33 dos alvéolos pulmonares em modelo murino, o que pode facilitar o estudo in vivo da fibrose pulmonar idiopática (FPI).
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Artigo de método
Transferência Adotiva de Macrófagos Estimulados por IL-33 em Modelos de Camundongos Induzidos por Bleomicina para Estudar seu Efeito na Fibrose Pulmonar Idiopática In Vivo
* These authors contributed equally
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Resumo
Resumo
A resposta inflamatória causada pela lesão pulmonar precoce é uma das causas importantes do desenvolvimento da fibrose pulmonar idiopática (FPI), que é acompanhada pela ativação de células inflamatórias, como macrófagos e neutrófilos, bem como pela liberação de fatores inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-1β e IL-6. Sabe-se que a inflamação precoce causada por macrófagos intersticiais (MIs) pulmonares ativados em resposta à estimulação com IL-33 desempenha um papel vital no processo patológico da FPI. Este protocolo descreve a transferência adotiva de MIs estimuladas por IL-33 para os pulmões de camundongos para estudar o desenvolvimento de FPI. Envolve o isolamento e a cultura de MIs primárias de pulmões de camundongos hospedeiros, seguida pela transferência adotiva de MIs estimuladas para os alvéolos de camundongos receptores de FPI induzidos por bleomicina (BLM) (que foram previamente depletados de macrófagos alveolares pelo tratamento com lipossomas clodronatos) e a avaliação patológica desses camundongos. Os resultados representativos mostram que a transferência adotiva de macrófagos estimulados por IL-33 agrava a fibrose pulmonar em camundongos, sugerindo que o estabelecimento do experimento de transferência adotiva de macrófagos é um bom meio técnico para estudar a patologia da FPI.
Introdução
A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é uma doença inflamatória pulmonar difusa causada por váriosfatores1. No microambiente de citocinas da resposta imune Th1 e Th2, os macrófagos podem ser polarizados em macrófagos classicamente ativados (M1) e, alternativamente, macrófagos ativados (M2). Os lipopolissacarídeos (LPS) ou a citocina IFN-γ induzem macrófagos M1 a polarizar e produzir citocinas pró-inflamatórias, incluindo iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Em contraste, as citocinas tipo II IL-4 e IL-13 conduzem a polarização dos macrófagos M2, que podem produzir diferentes fatores promotores de crescimento de fibroblastos, como TGF-β e PDGF, que pr....
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal Experimental da Universidade de Jiangnan (JN No. 20211130m1720615[501]).
NOTA: No total, 10 camundongos C57BL/6 machos com idade entre 6-8 semanas e pesando 20-25 g foram usados neste estudo. Os três grupos experimentais do estudo incluíram três camundongos receptores cada, e um camundongo hospedeiro foi usado para o isolamento IM.
1. Depleção de macrófagos pulmonares de camundongos
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Resultados
O protocolo aqui utilizado está resumido no fluxograma da Figura 1. A inalação de lipossomas clodronados pelo nariz (Figura 2) foi utilizada para esgotar os macrófagos pulmonares de camundongos adultos C57BL/6, o que produziu um bom modelo de camundongo receptor. As MIs pulmonares foram isoladas de outro camundongo (hospedeiro) não tratado (Figura 3A,B) e cultivadas in vitro. Os macrófagos isolados foram e.......
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Discussão
Este estudo fornece um método eficaz para depletar, isolar, cultivar e transferir macrófagos, o que pode ajudar no estudo dos mecanismos de fibrose pulmonar em camundongos. Existem vários métodos para a depleção de macrófagos em camundongos, como administração traqueal, injeção na veia caudal e inalação nasal11. Este estudo otimizou o método de inalação nasal, que é simples de operar e pode efetivamente esgotar macrófagospulmonares 8,9. Ap.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o Tópico Especial de Gestão de Laboratório da Universidade de Jiangnan: Construção da Biblioteca Digital Slice Baseada em Espécimes Patológicos (JDSYS202223) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81800065).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life technologies Biotecnologia,EUA | 1508012 | |
| Agulha arterial de demora | B Braun Melsingen AG,Alemanha | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson, EUA | ||
| Bleomicina | Biotang, EUA | Ab9465 | |
| Incubadora de dióxido de carbono | Thermo Forma, EUA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R & D Systems, EUA | 1124F | |
| CD11c | R & D Systems, EUA | N418 | |
| Placa de cultura de células | Thermo Forma, EUA | 174926 | |
| Lipossomas de clodronato | Lipossomas de clodronato, Holanda | CI-150-150 | |
| Colagenase A | Sigma-Aldrich, EUA | 10103578001 | |
| F4/80 | R& D Systems, EUA | 521204 | |
| Filtro de Células de Falcão | Becton, Dickinson and Company, EUA | 352340 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Life technologies, EUA | 1047571 | |
| Hematoxilina Eosina | Nanjing Jiancheng Technology, China | 06-570 | |
| LightCycler 480 Sistema de detecção de PCR | Roche, EUA | ||
| Fator recombinante murino IL-33 | Peprotech, EUA | 210-33 | |
| Microscópio Nikon | Nikon Corporation, Japão | 941185 | |
| Penicilina, estreptomicina | Tecnologias de vida, EUA | 877113 | |
| Fosfato tampão (PBS) | Tecnologia Microbiana de Guangdong Huankai, China | 1535882 | |
| tampão de lise RBC | Beyotime Biotechnology Company, China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company, China | R401-01-AA | Reagente de extração de RNA total |
| RWD Inalação Máquina de anestesia | Shenzhen Rayward Life Technology, China | R500 | |
| Parafina semiautomática fatiador | Leica, Alemanha | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japão | 410800 | |
| Tripsina 0,25% | Life Technologies, EUA | 1627172 |
Referências
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray an....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
