Este protocolo descreve um experimento de migração in vitro adequado para a análise funcional das moléculas envolvidas na migração in vivo de células da crista neural para a matriz extracelular rica em hialuronano.
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Artigo de método
In vitro Investigação dos Efeitos da Matriz Extracelular Rica em Hialuronano na Migração de Células da Crista Neural
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células da crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que se originam da região dorsal do tubo neural. A emigração de NCCs do tubo neural é um processo essencial para a produção de NCC e sua subsequente migração para os locais alvo. A rota migratória das NCCs, incluindo os tecidos do tubo neural circundantes, envolve matriz extracelular rica em hialuronano (AH). Para modelar a migração de NCC para esses tecidos circundantes ricos em AH a partir do tubo neural, um ensaio misto de migração de substrato consistindo de AH (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) e colágeno tipo I (Col1) foi estabelecido neste estudo. Este ensaio de migração demonstra que as células da linhagem celular NCC, O9-1, são altamente migratórias sobre o substrato misto e que o revestimento do AH é degradado no local das aderências focais no curso da migração. Este modelo in vitro pode ser útil para uma maior exploração das bases mecanicistas envolvidas na migração de NCC. Este protocolo também é aplicável para avaliar diferentes substratos como scaffolds para estudar a migração de NCC.
Introdução
As células da crista neural (NCCs) são uma população celular multipotente que está presente em embriões em desenvolvimento, e se originam da borda da placa neural durante a neurulação. Contribuem para a formação de uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso periférico, o sistema cardiovascular, os tecidos craniofaciais e o esqueleto1. Após indução e especificação da NCC na borda da placa neural, as NCCs emigram do neuroepitélio e migram para sítios teciduais derivados da NCC1.
O hialuronano (AH) é um glicosaminoglicano não sulfatado que se distribui em uma variedade de tecidos como ....
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Escola de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade de Osaka.
1. Cultura de células da crista neural do crânio de camundongos
NOTA: A linhagem celular da crista neural utilizada neste estudo compreende células O9-1, originalmente derivadas de Wnt1-Cre; Células que expressam R26R-GFP isoladas de embriões de camundongo E8.512 (ver discussão). O método aqui descrito para a cultura de células O9-1 segue um protocolo previamenteestabelecido13.
- Prepare a p....
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Resultados
Um ensaio de migração foi realizado em substratos mistos compostos por Col1 e AH de alto peso molecular (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) utilizando o protocolo aqui descrito. Células O9-1 no limite da falha migraram prontamente para a lacuna rica em AH (Figura 4). A imunomarcação para um marcador de AG, a vinculina14, confirmou que as células O9-1 formaram aderências focais (AGs) nos locais de degradação do AH (Figura 5).
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Discussão
Vários componentes do ECM regulam a emigração/migração do NCC. Por exemplo, o AH regula positivamente a migração deNCC2,15. Curiosamente, um estudo baseado em modelos genéticos murinos de Tmem2, uma hialuronidase de superfície celular, elucidou a exigência de degradação do AH na migração deNCC9. Os colágenos também são abundantes na MEC ao redor do tubo neural16. Demonstrou-se que a decorina, um pequeno proteoglican.......
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Divulgações
O autor declara que não existem interesses concorrentes.
Agradecimentos
Expresso grande reconhecimento a Fumitoshi Irie e Yu Yamaguchi por seu encorajamento e sugestões gentis no estabelecimento deste método. Este trabalho foi apoiado por bolsas de auxílio para programas de pesquisa científica da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (#19KK0232 para T.I., #20H03896 para T.I.). O método original para o revestimento de AH em substratos de vidro e ensaios de degradação in situ de AH nos substratos foi descrito em Yamamoto et al (2017)8, enquanto o método para a preparação de substratos mistos HA/Col1 foi descrito em Irie et al (2021)7.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de células de 10 cm | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. Não. BSS-1005-B | |
| Inserções de cultura de 2 poços | ibidi | Cat. Nº 80209 | |
| Alexa 555 com rótulo de cabra anti-rato IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Anticorpo secundário anti-rato derivado de cabra |
| contador de células automatizado | Bio-Rad | Cat. Não. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Meio de congelamento celular |
| colágeno tipo I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Célula ES Completa Média | Millipore | Cat. Não. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Soro fetal bovino | Gibco | Cat. 10270106 | |
| microscópio de fluorescência | Keyence | Cat. Não. BZ-X700 | |
| Fluoresent rotulado HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Prato de fundo Glas | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldeído | Sigma | Cat. Nº G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. Não. CB-40234 | O |
| anticorpo anti-vinculina monoclonal | Sigma | Cat. Não. Mídia de montagem V9264 | |
| Dako | S3023 | ||
| Soro de cabra normal | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 células | Millipore | Cat. Não. SCC049 | |
| Paraformaldeído | Sigma | Cat. 158127 | |
| trietoxissilano | Sigma | Cat. Nº 390143 | |
| tripsina-EDTA | Millipore | Cat. Não. SM-2003-C |
Referências
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is req....
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Reimpressões e permissões
