Aqui descrevemos um método tempo-específico para manipular efetivamente vias críticas de desenvolvimento na placenta de camundongos in vivo. Isto é realizado através da injeção e eletroporação de plasmídeos CRISPR nas placentas de fêmeas grávidas no dia embrionário 12.5.
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Artigo de método
Mouse In Vivo Placental Alvo CRISPR Manipulação
Neste artigo
Resumo
Resumo
A placenta é um órgão essencial que regula e mantém o desenvolvimento dos mamíferos no útero. A placenta é responsável pela transferência de nutrientes e resíduos entre a mãe e o feto e pela produção e entrega de fatores de crescimento e hormônios. Manipulações genéticas placentárias em camundongos são críticas para a compreensão do papel específico da placenta no desenvolvimento pré-natal. Camundongos transgênicos que expressam Cre específicos da placenta têm eficácia variável, e outros métodos para manipulação gênica placentária podem ser alternativas úteis. Este artigo descreve uma técnica para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação do gene CRISPR, que pode ser usada para modificar a expressão de genes-alvo. Usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, as fêmeas grávidas são submetidas a uma laparotomia no dia embrionário 12.5 (E12.5), e um plasmídeo CRISPR é entregue por uma micropipeta de vidro nas placentas individuais. O plasmídeo é eletroporado imediatamente após cada injeção. Após a recuperação da barragem, as placentas e embriões podem continuar o desenvolvimento até a avaliação em um momento posterior. A avaliação da placenta e da prole após o uso dessa técnica pode determinar o papel da função placentária tempo-específica no desenvolvimento. Esse tipo de manipulação permitirá uma melhor compreensão de como a genética e a função placentárias afetam o crescimento e o desenvolvimento fetal em múltiplos contextos patológicos.
Introdução
A placenta é um órgão essencial envolvido no desenvolvimento do feto. O principal papel da placenta é fornecer fatores essenciais e regular a transferência de nutrientes e resíduos de e para o feto. As placentas de mamíferos são compostas por tecido fetal e materno, que compõem a interface feto-materna e, portanto, a genética da função de impacto materno-fetal1. Anomalias genéticas ou função prejudicada da placenta podem alterar drasticamente o desenvolvimento fetal. Trabalhos anteriores mostraram que a genética e o desenvolvimento placentário estão associados ao desenvolvimento alterado de sistemas orgânicos específicos no feto. Particularment....
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as regulamentações federais e a política da Universidade de Iowa e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
1. Animais e criação
- Manter os animais em um ciclo diurno de 12 h com ração e água ad libitum.
- Use camundongos fêmeas CD-1 com idade entre 8-15 semanas. Utilizar a presença de um tampão copulatório para identificar o E0.5.
- Na E0.5, abrigar isoladamente as represas prenhes.
2. Calibração da micropipeta
NOTA: A calibração ....
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Resultados
Resultados gerais do procedimento (Figura 6)
No estudo, houve três grupos manipulados. Estes incluíram placentas injetadas com um plasmídeo de controle geral CRISPR Cas9 (Cas9 Control), um plasmídeo CRISPR de controle de ativação (Act Control), ou um plasmídeo de ativação de IGF-1 SAM (Igf1-OE). O Cas9 Control é mais adequado para plasmídeos knockout, e o controle de ativação é mais adequado para plasmídeos de superexpressão/ativação. Para avalia.......
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Discussão
A placenta é um regulador primário do crescimento fetal e, como observado anteriormente, alterações na expressão ou função gênica placentária podem afetar significativamente o desenvolvimento fetal6. O protocolo descrito aqui pode ser usado para realizar uma manipulação CRISPR in vivo direcionada da placenta de camundongo usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada. Esta técnica permite um rendimento significativo de embriões viáveis e suas placentas correspondentes que podem se.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem as seguintes fontes de financiamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Os autores agradecem aos laboratórios do Dr. Val Sheffield e do Dr. Calvin Carter na Universidade de Iowa pelo uso de sua sala de cirurgia e equipamentos, bem como ao Dr. Eric Van Otterloo, ao Dr. Nandakumar Narayanan, e ao Dr. Matthew Weber por sua assistência com microscopia. Os autores também agradecem à Dra. Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu por sua assistência com as cirurgias piloto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,5 ml | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) em PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899. | |
| 96 Placa de poço | Cornings | 3598 | para kit BCA |
| Absorvente Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Controle de Ativação Plasmídeo | Santa Cruz Biotecnologia | sc-437275 | Água sem Dnase fornecida para diluição |
| AMV Transcriptase Reversa | New England Biolabs | M0277L | Uso para síntese de cDNA |
| Anestésico Vaporizador de Gás | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact Vaporizador |
| Gel Lacrimal Artificial | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Kit de Ensaio de Proteína BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Quantificação de proteínas |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Homogeneizador de tecidos portátil |
| Software CellSens Olympus | V4.1.1 | Processamento de imagens para imagens FISH. | |
| Centrífuga 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Centrífuga |
| de placa Clorofórmio | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | Isolamento de RNA |
| Aplicadores com ponta de algodão | ProAdvantage | 77100 | Esterilizar antes de usar |
| Plasmídeo de controle CRISPR/Cas9 | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Água sem Dnase fornecida para diluição |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Leica | M125 C | Usado para imagens pós-necroscopia | |
| Suturas solúveis | Med Vet International | J385H | |
| Água Destilada | Gibco | 15230162 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Cálcio; (-) Eletroporador Eletro de Magnésio |
| ECM 830 (Máquina de Eletroporação) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Apenas gerador |
| Barbeador elétrico | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm de diâmetro das pás; fios incluídos |
| de embutimento: 250 PK | Grainger | 21RK94 | de incorporação de placenta |
| Etanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Filtro de isoflurano em excesso |
| Corante Verde Rápido FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolver em 1 μ g/ml e filtro; proteger da luz |
| Fotômetro de microplacas baseado em filtro (leitor de placas) | Fisher Scientific | 14377576 | Pode ser usado para BCA e ELISA |
| Fórceps | VWR | 82027-386 | Pontas finas, retas, serrilhadas |
| Solução de formalina, tamponada neutra, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Capilares de vidro - Vidro borossilicato (micropipeta) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1,5 mm, I.D.: 0,86 mm, 10 cm de comprimento |
| Halt Cocktail de inibidores de protease e fosfatase (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Tampão de homogeneização de proteínas |
| Almofada de aquecimento | Thermotech | S766D | Almofada de aquecimento húmida digital |
| VWR | 10806-188 | Mandíbula totalmente surrated; curvo | |
| Banho de água quente | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmídeo (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Água sem dnase fornecida para diluição |
| Câmara de indução | Vetamac | 941443 | Não é necessário tamanho específico de litro |
| Isoflurano | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | Isolamento de RNA |
| Cetamina HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Cloreto de Magneisum | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Tampão de homogeneização de proteínas |
| MicroAmp™ Placa de reação óptica de 384 poços com código de barras | Fisher Scientific | 4309849 | placas com código de barras não necessárias |
| Ponta microcapilar | Eppendorf | 5196082001 | Anexado ao microinjetor BTX |
| Microinjetor | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 Suporte de | pipeta de aço inoxidável, 130 mm de comprimento, para pipetas de 1 a 1,5 mm |
| Microject 1000A (máquina de injeção) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | do sistema MicroJect 1000A Plus |
| Modelo P-97 | Instrumento Sutter | P-97 | Extrator de micropipeta tipo flamejante/marrom |
| Misturador de microplacas (agitador de placas) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rato IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Agulhas | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Tanque de nitrogênio | Linde | 7727-37-9 | Qualquer gás inerte |
| Anti-inflamatório não esteróide (AINE) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analégico como Meloxicam |
| Cone de nariz | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Corante de detecção Opal 620 | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Usado para PEIXE |
| Composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT) Tanque | Sakura | 4583 | |
| Linde | 7782 - 44 - 7 | Pilões de oxigênio de grau médico | |
| USA Scientific Inc | 14155390 | ||
| Iodo-Povidona, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Potência SYBR™ Uso científico 4367659 | Thermo Fisher da | do PCR para | |
| Hexamers aleatórios do qPCR (primeiras demão aleatórias) | Uso de New England Biolabs | S1330S | para a síntese do cDNA |
| de Grainger | 26X080 | lâmina de barbear | |
| & Concentrador | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contém todos os reagentes necessários para hibridização fluorescente in situ. Sondas vendidas separadamente. |
| RNAscope™ Sonda- MM-Prl8A8-C2 | Diagnóstico Avançado de Células | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Sonda- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Diagnóstico Avançado de Células | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Forno seco para hibridização in situ |
| Tesoura | VWR | 82027-578 | Tesoura de dissecação, ponta afiada, 4¹/? |
| Cloreto de Sódio (Salino) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Estéril, 0.9% |
| Citrato de Sódio, Sal Trissódico, Dihidratado, [Ácido Cítrico, Trissódico Dihidratado] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Hidróxido de Sódio 1N Concentrado, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Tampão de homogeneização de proteína Vaporizador |
| Bella | B00DPX8UBA | ||
| Campo cirúrgico estéril | Busse | 696 | Esterilize antes de usar |
| Lâminas de microscópio Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Seringas | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Seringa estéril, uso único, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ Um espectrofotômetro com WiFi e Qubit™ 4 Fluorômetro | Fisher Scientific | 13-400-525 | Esta configuração vem com o fluorômetro Qubit 4. A quantificação de qubits não é necessária. |
| Adesivo de Tecido | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Tampão de homogeneização de proteínas |
| TRIzol™ Reagente | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolamento |
| TSA Buffer Pack | Cells Diagnostics | 322810 | Usado para diluir o corante de detecção Opal 620 |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Anexado ao vaporizador e aos acessórios do vaporizador |
| Microscópio de fluorescência composto vertical | Olympus | BX61VS | Usado para imagens FISH |
| Vectorshield com DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mídia de montagem de lamínula |
| ViiA™ 7 Sistema de PCR em Tempo Real com Bloco de 384 Poços | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | Este é para detecção de bloco SYBR de 384 poços. TaqMan e/ou blocos menores disponíveis |
| Esmalte Wet n Wild Brilho Selvagem, Protetor de Unhas Transparente, Cor de Unhas | Amazon | C450B | |
| Xilazina 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
Referências
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- ....
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Reimpressões e permissões
