Aqui descrevemos um método tempo-específico para manipular efetivamente vias críticas de desenvolvimento na placenta de camundongos in vivo. Isto é realizado através da injeção e eletroporação de plasmídeos CRISPR nas placentas de fêmeas grávidas no dia embrionário 12.5.
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Artigo de método
Mouse In Vivo Placental Alvo CRISPR Manipulação
Neste artigo
Resumo
Resumo
A placenta é um órgão essencial que regula e mantém o desenvolvimento dos mamíferos no útero. A placenta é responsável pela transferência de nutrientes e resíduos entre a mãe e o feto e pela produção e entrega de fatores de crescimento e hormônios. Manipulações genéticas placentárias em camundongos são críticas para a compreensão do papel específico da placenta no desenvolvimento pré-natal. Camundongos transgênicos que expressam Cre específicos da placenta têm eficácia variável, e outros métodos para manipulação gênica placentária podem ser alternativas úteis. Este artigo descreve uma técnica para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação do gene CRISPR, que pode ser usada para modificar a expressão de genes-alvo. Usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, as fêmeas grávidas são submetidas a uma laparotomia no dia embrionário 12.5 (E12.5), e um plasmídeo CRISPR é entregue por uma micropipeta de vidro nas placentas individuais. O plasmídeo é eletroporado imediatamente após cada injeção. Após a recuperação da barragem, as placentas e embriões podem continuar o desenvolvimento até a avaliação em um momento posterior. A avaliação da placenta e da prole após o uso dessa técnica pode determinar o papel da função placentária tempo-específica no desenvolvimento. Esse tipo de manipulação permitirá uma melhor compreensão de como a genética e a função placentárias afetam o crescimento e o desenvolvimento fetal em múltiplos contextos patológicos.
Introdução
A placenta é um órgão essencial envolvido no desenvolvimento do feto. O principal papel da placenta é fornecer fatores essenciais e regular a transferência de nutrientes e resíduos de e para o feto. As placentas de mamíferos são compostas por tecido fetal e materno, que compõem a interface feto-materna e, portanto, a genética da função de impacto materno-fetal1. Anomalias genéticas ou função prejudicada da placenta podem alterar drasticamente o desenvolvimento fetal. Trabalhos anteriores mostraram que a genética e o desenvolvimento placentário estão associados ao desenvolvimento alterado de sistemas orgânicos específicos no feto. Particularmente, anormalidades na placenta estão ligadas a alterações no cérebro, coração e sistema vascular fetal2,3,4,5.
O transporte de hormônios, fatores de crescimento e outras moléculas da placenta para o feto desempenha um papel importante no desenvolvimento fetal6. Tem sido demonstrado que alterar a produção placentária de moléculas específicas pode alterar o neurodesenvolvimento. A inflamação materna pode aumentar a produção de serotonina por alterar a expressão gênica metabólica do triptofano (TRP) na placenta, o que, posteriormente, cria um acúmulo de serotonina no cérebro fetal7. Outros estudos encontraram anormalidades placentárias ao lado de defeitos cardíacos. Acredita-se que anormalidades na placenta contribuam para defeitos cardíacos congênitos, o defeito congênito mais comum em humanos8. Um estudo recente identificou vários genes que têm vias celulares semelhantes na placenta e no coração. Se rompidas, essas vias podem causar defeitos em ambos os órgãos9. Os defeitos na placenta podem exacerbar defeitos cardíacos congênitos. O papel da genética e função placentária no desenvolvimento de sistemas de órgãos fetais específicos é um campo de estudo emergente.
Camundongos possuem placentas hemocoriais e outras características das placentas humanas, o que os torna modelos altamente úteis para o estudo de doenças humanas1. Apesar da importância da placenta, atualmente há uma falta de manipulações genéticas direcionadas in vivo. Além disso, atualmente há mais opções disponíveis para knockouts ou knockdowns do que manipulações de superexpressão ou ganho de função na placenta10. Existem várias linhas transgênicas de Cre-expressando para manipulação placentária-específica, cada uma em diferentes linhagens de trofoblastos em diferentes pontos de tempo. Estes incluem Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Embora esses transgenes Cre sejam eficientes, eles podem não ser capazes de manipular alguns genes em pontos de tempo específicos. Outro método comumente utilizado para nocautear ou superexpressar a expressão gênica placentária é a inserção de vetores lentivirais em cultura de blastocisto, o que causa uma manipulação genética trofoblasto-específica15,16. Esta técnica permite uma mudança robusta na expressão gênica placentária no início do desenvolvimento. O uso de RNA de interferência in vivo tem sido pouco utilizado na placenta. A inserção de plasmídeos de shRNA pode ser realizada de forma semelhante à técnica CRIPSR descrita neste trabalho. Isso foi feito no E13.5 para diminuir com sucesso a expressão de PlGF na placenta, com impactos na vasculatura cerebral da prole17.
Além das técnicas que são usadas principalmente para knockout ou knockdown, a indução da superexpressão é comumente realizada com adenovírus ou a inserção de uma proteína exógena. As técnicas utilizadas para superexpressão têm taxas variáveis de sucesso e têm sido realizadas, na maioria das vezes, mais tardiamente na gestação. Para investigar o papel do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) na função placentária, uma transferência gênica placentária mediada por adenovírus foi realizada para induzir a superexpressão do gene IGF-1 18,19. Isso foi realizado no final da gestação de camundongos com E18.5 por injeção direta na placenta. Para fornecer opções adicionais e contornar possíveis falhas de manipulações genéticas placentárias estabelecidas, como falhas na combinação Cre-Lox, a possível toxicidade de adenovírus e os efeitos fora do alvo do shRNA, a manipulação direta in vivo de CRISPR da placenta pode ser usada20,21,22. Este modelo foi desenvolvido para resolver a falta de modelos de superexpressão e para criar um modelo com flexibilidade.
Essa técnica é baseada no trabalho de Lecuyer e cols., no qual plasmídeos shRNA e CRISPR foram direcionados diretamente in vivo para placentas de camundongos para alterar a expressão de PlGF 17. Esta técnica pode ser usada para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação de CRISPR em vários pontos de tempo; para este trabalho, foi selecionado o E12.5. A placenta já amadureceu a esse ponto e é grande o suficiente para manipular, permitindo a inserção de um plasmídeo CRISPR específico no E12.5, o que pode ter um impacto significativo no desenvolvimento fetal a partir de meados da gestação23,24. Ao contrário das abordagens transgênicas, mas semelhantes às induções virais ou interferência de RNA, esta técnica permite a superexpressão ou knockout em pontos de tempo específicos usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, evitando assim possível placentação prejudicada ou letalidade embrionária de alterações anteriores. Como apenas algumas placentas recebem o plasmídeo experimental ou de controle dentro de uma ninhada, a abordagem permite dois tipos de controles internos. Esses controles são aqueles injetados e eletroporados com o plasmídeo de controle apropriado e aqueles que não recebem manipulação direta. Esta técnica foi otimizada para criar uma superexpressão do gene IGF-1 na placenta de camundongos através de um plasmídeo CRISPR mediador de ativação sinérgica (SAM). O gene IGF-1 foi escolhido, pois o IGF-1 é um hormônio de crescimento essencial entregue ao feto que é primariamente produzido na placenta antes do nascimento25,26. Esta nova técnica CRISPR direcionada à placenta permitirá a manipulação direta para ajudar a definir a conexão entre a função placentária e o desenvolvimento fetal.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as regulamentações federais e a política da Universidade de Iowa e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
1. Animais e criação
- Manter os animais em um ciclo diurno de 12 h com ração e água ad libitum.
- Use camundongos fêmeas CD-1 com idade entre 8-15 semanas. Utilizar a presença de um tampão copulatório para identificar o E0.5.
- Na E0.5, abrigar isoladamente as represas prenhes.
2. Calibração da micropipeta
NOTA: A calibração da micropipeta deve ser realizada antes da cirurgia, quando possível.
- Antes de fazer e calibrar a micropipeta, diluir todos os plasmídeos até a concentração recomendada (0,1 μg/μL) em água livre de DNase. Misturar o plasmídeo com o corante Fast Green adequadamente diluído (1 μg/μL em PBS) (concentração final do plasmídeo: 0,06 μg/μL).
- Puxe as micropipetas usando capilares de vidro de 10 cm com diâmetro externo de 1,5 mm e diâmetro interno de 0,86 mm com um puxador de micropipetas.
- Quebre cuidadosamente a ponta de uma micropipeta (2-3 mm) com pinças estéreis.
- Coloque a micropipeta em uma ponta microcapilar conectada a um microinjetor. Verifique se o microinjetor está conectado à máquina de microinjeção e se há níveis suficientes de nitrogênio para calibrar a micropipeta.
- Uma vez que a micropipeta esteja conectada ao microinjetor, carregue-a com a solução de corante Fast Green para realizar a calibração (1 μg/μL em PBS). Calibrar a micropipeta para injetar um volume de aproximadamente 3,5 μL. Esvaziar ("limpar") a micropipeta em preparação para carregar as soluções de plasmídeo conforme abaixo.
NOTA: Cada micropipeta será ligeiramente diferente. Para evitar danificar a placenta durante a injeção, o tempo de injeção deve ser definido entre 0,5-1,5 s. A pressão deve ser ajustada entre 1-8,5 psi. Calibrar cada micropipeta separadamente; Se a micropipeta não puder ser calibrada dentro desses parâmetros, ela não deve ser usada.
3. Cirurgia (Figura 1A)
OBS: Para o preparo, limpe as superfícies das áreas de preparo e cirúrgicas com etanol 70%. Coloque uma almofada absorvente na área de preparação. Na área da cirurgia, coloque uma almofada de aquecimento para baixo e, em seguida, coloque uma almofada absorvente em cima desta. Esterilizar todas as ferramentas antes da cirurgia. O tempo que a barragem está sob anestesia deve ser inferior a 1 h.
- Anesthetization
- Administrar 5 mg/kg de AINE (meloxicam) ou outro analgésico aprovado à mãe gestante 30 min a 1 h antes da cirurgia.
- Coloque a barragem gestante em uma câmara de indução acoplada a um vaporizador de isoflurano.
- Ajuste o vaporizador para isoflurano a 4% e oxigênio a 3,5 L/min.
- Uma vez confirmada a anestesia pela falta de resposta a uma pinça do dedo do pé e uma taxa respiratória reduzida, remova a barragem da câmara de indução para a área de preparação.
- Preparo cirúrgico
- Na área de preparação, coloque a barragem em decúbito dorsal com um cone nasal.
- Reduzir o vaporizador para 2% de isoflurano e 3,5 L/min de oxigênio enquanto a barragem estiver no cone nasal.
- Faça a barba bem no abdômen da barragem e remova o excesso de pelos. Revestimento alternado do abdome raspado com solução de povidona e etanol 70% três vezes com aplicadores estéreis com ponta de algodão. Aplicar camada final de solução de povidona. Para evitar o ressecamento da córnea, colocar gel de lágrima artificial sobre os dois olhos da barragem (Figura 2A, B).
- Após o preparo, mova a barragem com o cone nasal para a área de cirurgia designada.
- Laparotomia uterina
OBS: Utilizar luvas estéreis durante todo o procedimento cirúrgico. Troque as luvas se alguma superfície não estéril for contatada.- Na área da cirurgia, coloque a barragem em decúbito dorsal e fixe o cone nasal no lugar com fita adesiva. Ajuste a almofada de aquecimento por baixo da almofada absorvente para 45 °C.
- Usando pinça e tesoura, faça uma incisão mediana de aproximadamente 2 cm através da pele. Use pinças para atendar a pele e faça uma incisão vertical na pele. Depois disso, faça outra incisão de tamanho semelhante através do peritônio para expor os cornos uterinos. Com pinças, tenda o peritônio enquanto se faz a incisão vertical (Figura 2C, D).
NOTA: A falha em tenda adequada durante a incisão do peritônio pode levar a uma incisão fatal dos intestinos. - Massageie suavemente os cornos uterinos através da incisão, pressionando os lados do abdômen. Faça isso guiando cuidadosamente o útero sem ferramentas, usando apenas os dedos para evitar lesões acidentais. Coloque o útero exposto em cima de um pano cirúrgico estéril cobrindo o abdome da barragem e mantenha-o úmido durante toda a cirurgia com gotas de soro fisiológico estéril, que pode ser aquecido a 30 °C antes do uso, conforme necessário (Figura 2E, F).
NOTA: Os cornos uterinos podem ser identificados conforme descrito em Wang et al.27. - Uma vez que o útero está exposto, selecione três pares de placentas para manipulação.
NOTA: As placentas podem ser identificadas conforme descrito por Elmore et al.24. Para maximizar a sobrevivência dos embriões, não mais do que 6 placentas devem ser tratadas. Se houver menos de 12 embriões presentes, não mais do que 4 placentas devem ser injetadas. Selecionar duas placentas adjacentes para que uma receba uma injeção controle e a outra receba o plasmídeo experimental. O uso de duas placentas adjacentes permite uma melhor comparação de placentas em localizações semelhantes no útero e também possibilita um aumento da taxa de sobrevida. Os pares placentários selecionados são escolhidos aleatoriamente e espaçados ao longo de ambos os cornos uterinos (Figura 1B). - Registrar a localização das manipulações placentárias e a organização dos embriões dentro dos cornos uterinos para que os embriões e placentas possam ser identificados durante a coleta, pois uma mãe carregará placentas/embriões controlados e tratados experimentalmente.
- Injeção placentária e eletroporação do plasmídeo controle
OBS: Para manter uma técnica asséptica, esterilizar as pás de eletroporação e o microinjetor com um esterilizante a frio antes do uso. Troque as luvas se alguma superfície não estéril for contatada.- Usando a micropipeta calibrada, carregar uma quantidade suficiente do plasmídeo de controle apropriado para três injeções. Realizar todas as injeções a uma profundidade de ~0,5 mm lateralmente na placenta entre a decídua (branca) e a zona juncional (vermelho escuro) (Figura 3A-F).
- Realizar injeções nas três placentas de controle.
NOTA: Realizar todas as injeções de plasmídios de controle antes das injeções experimentais para evitar a contaminação cruzada dos plasmídeos com a micropipeta. Isso permitirá que a mesma micropipeta seja usada, pois a troca de micropipetas e o tempo de calibração aumentam drasticamente o tempo de cirurgia e diminuem a sobrevivência da barragem. - Realizar eletroporação das placentas de controle injetadas por plasmídeos dentro de 2 min após a injeção.
- Para a eletroporação, use um par de pás de 3 mm acopladas a uma máquina de eletroporação. Para garantir a eficiência da incorporação CRISPR e a viabilidade dos embriões, use as seguintes configurações de eletroporação: 2 pulsos, 30 V, pulso de 30 ms, pulso de 970 ms desligado, unipolar.
- Após a injeção, mas imediatamente antes da eletroporação, cubra os locais de contato com soro fisiológico estéril, aplicando o soro fisiológico precisamente nos três locais da parede uterina e nas pás com um conta-gotas ou seringa.
- Pressione suavemente as pás de eletroporação nas laterais da placenta. Coloque a pá do ânodo sobre o local de injeção e o cátodo diretamente oposto (Figura 4A-C).
- Pressione o pulso na máquina de eletroporação e aguarde a conclusão dos dois pulsos antes de remover as pás de eletroporação.
NOTA: Uma pequena quantidade de espuma branca é frequentemente vista entre as pás e a placenta durante os pulsos. Se isso não ocorrer, verifique a tensão das pás com um voltímetro antes de usar novamente. Se a leitura no voltímetro não corresponder à configuração de tensão de eletroporação, as pás não funcionarão.
- Injeção placentária e eletroporação do plasmídeo experimental
- Siga as mesmas instruções da etapa 3.4.1. para a etapa 3.4.2. usando o plasmídeo experimental em vez do plasmídeo controle.
- Realizar a eletroporação das três placentas experimentais injetadas dentro de 2 min após a injeção. Isso deve ser realizado da mesma maneira que para aqueles injetados com os plasmídeos de controle. Siga o passo 3.4.4. para a etapa 3.4.7.
- Conclusão da cirurgia
- Uma vez concluída a manipulação placentária, massageie suavemente os cornos uterinos de volta para dentro da cavidade abdominal usando apenas os dedos (Figura 5A).
- Primeiro, realizar suturas simples com dois nós na camada de peritônio usando suturas solúveis revestidas e trançadas com 45 cm de comprimento e uma liga de agulha 3/8c de 13 mm. Espaçar as suturas a 2-3 mm de distância (Figura 5B).
- Após sutura da camada peritoneal, sutura da pele com pontos solúveis. Nó triplo, as suturas únicas com 2-3 mm de distância para garantir que a barragem não possa desfazer a sutura (Figura 5C).
- Concluída a sutura, fixa-se o isoflurano a 1% e o oxigênio a 3,5 L/min, aplicando-se adesivo tecidual nas suturas sobre a pele (Figura 5D).
NOTA: O adesivo tecidual é opcional, mas recomendado para evitar a reabertura da incisão devido à mastigação da barragem. - Quando o adesivo de tecido tiver secado, desligue o vaporizador e remova a barragem da área da cirurgia. Coloque a barragem em uma gaiola de apoio nas costas.
4. Cuidados e acompanhamento pós-cirúrgico
- Permita que a mãe grávida se recupere em uma gaiola limpa sob supervisão por um mínimo de 30 minutos para garantir que não haja complicações imediatas da cirurgia. Observe até que esteja totalmente deambulado e possa virar para os pés sem assistência. Abriga isoladamente a barragem pós-cirurgia.
- Acompanhar os cuidados institucionais pós-operatórios e acompanhamento até a coleta do embrião. Registre o peso da barragem e monitore diariamente as suturas e o local da incisão.
5. E14.5 coleção placentária
- No E14.5, anestesiar profundamente a barragem com um coquetel de ketamina/xilazina (1 mg/mL de quetamina e 0,1 mg/mL de xilazina) e, em seguida, deslocar cervicamente a barragem.
- Faça uma incisão em forma de V no abdômen da barragem com tesoura e remova o útero. Coloque imediatamente em uma placa de Petri de 5 cm sobre gelo. Usando fórceps, remova cuidadosamente o embrião e a placenta correspondente do útero.
NOTA: Manter um registro da localização do embrião e placenta correspondente nos cornos uterinos para determinar qual recebeu a manipulação direta durante a cirurgia. - Registre os pesos placentários. Usando pinças e lâminas de barbear sem RNAse, corte a placenta ao meio na linha média. Colocar metade em 4% de PFA a 4 °C. Corte a metade restante ao meio novamente e armazene os dois quartos restantes a -80 °C em dois tubos, um com reagente de armazenamento de RNA.
NOTA: Embriões e outros tecidos maternos podem ser armazenados da coleção a -80 °C para uso futuro.
6. Análise da expressão gênica placentária
- Use o quarto da placenta armazenado a -80 °C no reagente de armazenamento de RNA.
- Processar as placentas para qPCR como descrito em Elser e col. usando o método Trizol para isolamento de RNA, um espectrofotômetro para concentração de RNA, um kit de síntese de cDNA e qPCR com SYBR Green Master Mix28. No lugar do kit Turbo DNAfree referenciado em Elser et al., utilizar um kit de limpeza de RNA após o isolamento do RNA Trizol para garantir que as amostras não contenham contaminantes28.
NOTA: Leia a ficha de dados de segurança do material (FISPQ) para Trizol e use-a em um exaustor de fumaça química. - Avaliar a inserção plasmidial do plasmídeo controle com primers de GFP e do plasmídeo experimental com primers BLAST (primers listados na Tabela Suplementar 1). Use o valor de CT para determinar a presença do plasmídeo.
NOTA: Valores de TC acima de 35 são falsos positivos, e apenas aqueles abaixo de 35 devem ser considerados um indicador positivo de que o plasmídeo foi inserido com sucesso. - Avaliar a expressão placentária de IGF-1 normalizada para o gene housekeeping 18s (primers listados na Tabela Suplementar 1). Use o método ddCT para calcular a mudança de dobra e, em seguida, calcular a mudança de dobra normalizada das amostras experimentais para a mudança média de dobra das amostras controle.
7. Análise do nível de proteína placentária
- Use o quarto da placenta que foi armazenada a -80 °C. Homogeneizar o tecido em uma solução tampão à frente de 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 e 10 mM inibidor de protease em diH2 O com pH final de 7,4. Use um homogeneizador portátil e pilão para quebrar o tecido.
NOTA: A amostra não deve exceder 10% do volume do buffer. - Diluir as amostras homogeneizadas no tampão a 1:12, de modo a que estejam dentro do intervalo detectável de um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA). Realizar o ensaio de BCA de acordo com as instruções do fabricante e quantificar a proteína total usando um leitor de placas.
- Após a realização do ensaio de BCA, normalizar todas as amostras para a mesma concentração de proteína total de 2 mg/mL para o ELISA de IGF-1, como feito em Gumusoglu et al.29.
- Realizar o ELISA de IGF-1 de acordo com as instruções do fabricante e quantificar os níveis de proteína IGF-1 com um leitor de placas usando uma curva de concentração padrão.
8. Verificação espacial do CRIPSR usando marcação fluorescente em hibridização in situ
- Depois que as metades placentárias tiverem sido adequadamente fixadas em PFA a 4% a 4 °C por 1-3 dias, mova-as para sacarose a 20% a 4 °C antes de congelá-las em composto de temperatura de corte ótima (OCT).
- Seccione serialmente as metades da placenta emblocadas em OCT em um criostato de -20 °C em seções de 10 μm e coloque-as em lâminas para serem marcadas. Seccione a placenta pela metade, de modo que todas as três sub-regiões sejam visíveis. Conservar as lâminas a -80 °C até à utilização para hibridização in situ .
- Realizar marcação por hibridação in situ fluorescente (FISH) seguindo os protocolos do fabricante. Hibridizar uma lâmina com uma sonda dCas9-3xNLS-VP64 e uma segunda lâmina "irmã" da mesma placenta com uma sonda Prl8a8.
NOTA: A sonda dCas9-3xNLS-VP64 detecta a presença do plasmídeo de superexpressão. A sonda Prl8a8 destaca espongiotrofoblastos da zona juncional, o que permite identificar as sub-regiões da placenta. Essas duas sondas são marcadas em lâminas "irmãs" separadas para evitar a interferência da fluorescência multicanal com a autofluorescência verde nas placentas. - Rotule ambas as sondas com o corante de detecção (Opal 620). Depois de completar o protocolo do fabricante para FISH, aplique o meio de montagem DAPI e coloque uma tampa na lâmina. Sele a lamínula com esmalte transparente.
- Obtenha imagens das lâminas em um microscópio de fluorescência composto vertical e processe-as usando um software de processamento de imagem apropriado. Aqui, foi utilizado o software CellSens.
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Resultados
Resultados gerais do procedimento (Figura 6)
No estudo, houve três grupos manipulados. Estes incluíram placentas injetadas com um plasmídeo de controle geral CRISPR Cas9 (Cas9 Control), um plasmídeo CRISPR de controle de ativação (Act Control), ou um plasmídeo de ativação de IGF-1 SAM (Igf1-OE). O Cas9 Control é mais adequado para plasmídeos knockout, e o controle de ativação é mais adequado para plasmídeos de superexpressão/ativação. Para avalia...
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Discussão
A placenta é um regulador primário do crescimento fetal e, como observado anteriormente, alterações na expressão ou função gênica placentária podem afetar significativamente o desenvolvimento fetal6. O protocolo descrito aqui pode ser usado para realizar uma manipulação CRISPR in vivo direcionada da placenta de camundongo usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada. Esta técnica permite um rendimento significativo de embriões viáveis e suas placentas correspondentes que podem se...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem as seguintes fontes de financiamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Os autores agradecem aos laboratórios do Dr. Val Sheffield e do Dr. Calvin Carter na Universidade de Iowa pelo uso de sua sala de cirurgia e equipamentos, bem como ao Dr. Eric Van Otterloo, ao Dr. Nandakumar Narayanan, e ao Dr. Matthew Weber por sua assistência com microscopia. Os autores também agradecem à Dra. Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu por sua assistência com as cirurgias piloto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,5 ml | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) em PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899. | |
| 96 Placa de poço | Cornings | 3598 | para kit BCA |
| Absorvente Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Controle de Ativação Plasmídeo | Santa Cruz Biotecnologia | sc-437275 | Água sem Dnase fornecida para diluição |
| AMV Transcriptase Reversa | New England Biolabs | M0277L | Uso para síntese de cDNA |
| Anestésico Vaporizador de Gás | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact Vaporizador |
| Gel Lacrimal Artificial | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Kit de Ensaio de Proteína BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Quantificação de proteínas |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Homogeneizador de tecidos portátil |
| Software CellSens Olympus | V4.1.1 | Processamento de imagens para imagens FISH. | |
| Centrífuga 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Centrífuga |
| de placa Clorofórmio | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | Isolamento de RNA |
| Aplicadores com ponta de algodão | ProAdvantage | 77100 | Esterilizar antes de usar |
| Plasmídeo de controle CRISPR/Cas9 | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Água sem Dnase fornecida para diluição |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Leica | M125 C | Usado para imagens pós-necroscopia | |
| Suturas solúveis | Med Vet International | J385H | |
| Água Destilada | Gibco | 15230162 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Cálcio; (-) Eletroporador Eletro de Magnésio |
| ECM 830 (Máquina de Eletroporação) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Apenas gerador |
| Barbeador elétrico | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm de diâmetro das pás; fios incluídos |
| de embutimento: 250 PK | Grainger | 21RK94 | de incorporação de placenta |
| Etanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Filtro de isoflurano em excesso |
| Corante Verde Rápido FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolver em 1 μ g/ml e filtro; proteger da luz |
| Fotômetro de microplacas baseado em filtro (leitor de placas) | Fisher Scientific | 14377576 | Pode ser usado para BCA e ELISA |
| Fórceps | VWR | 82027-386 | Pontas finas, retas, serrilhadas |
| Solução de formalina, tamponada neutra, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Capilares de vidro - Vidro borossilicato (micropipeta) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1,5 mm, I.D.: 0,86 mm, 10 cm de comprimento |
| Halt Cocktail de inibidores de protease e fosfatase (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Tampão de homogeneização de proteínas |
| Almofada de aquecimento | Thermotech | S766D | Almofada de aquecimento húmida digital |
| VWR | 10806-188 | Mandíbula totalmente surrated; curvo | |
| Banho de água quente | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmídeo (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Água sem dnase fornecida para diluição |
| Câmara de indução | Vetamac | 941443 | Não é necessário tamanho específico de litro |
| Isoflurano | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | Isolamento de RNA |
| Cetamina HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Cloreto de Magneisum | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Tampão de homogeneização de proteínas |
| MicroAmp™ Placa de reação óptica de 384 poços com código de barras | Fisher Scientific | 4309849 | placas com código de barras não necessárias |
| Ponta microcapilar | Eppendorf | 5196082001 | Anexado ao microinjetor BTX |
| Microinjetor | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 Suporte de | pipeta de aço inoxidável, 130 mm de comprimento, para pipetas de 1 a 1,5 mm |
| Microject 1000A (máquina de injeção) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | do sistema MicroJect 1000A Plus |
| Modelo P-97 | Instrumento Sutter | P-97 | Extrator de micropipeta tipo flamejante/marrom |
| Misturador de microplacas (agitador de placas) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rato IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Agulhas | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Tanque de nitrogênio | Linde | 7727-37-9 | Qualquer gás inerte |
| Anti-inflamatório não esteróide (AINE) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analégico como Meloxicam |
| Cone de nariz | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Corante de detecção Opal 620 | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Usado para PEIXE |
| Composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT) Tanque | Sakura | 4583 | |
| Linde | 7782 - 44 - 7 | Pilões de oxigênio de grau médico | |
| USA Scientific Inc | 14155390 | ||
| Iodo-Povidona, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Potência SYBR™ Uso científico 4367659 | Thermo Fisher da | do PCR para | |
| Hexamers aleatórios do qPCR (primeiras demão aleatórias) | Uso de New England Biolabs | S1330S | para a síntese do cDNA |
| de Grainger | 26X080 | lâmina de barbear | |
| & Concentrador | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contém todos os reagentes necessários para hibridização fluorescente in situ. Sondas vendidas separadamente. |
| RNAscope™ Sonda- MM-Prl8A8-C2 | Diagnóstico Avançado de Células | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Sonda- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Diagnóstico Avançado de Células | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Forno seco para hibridização in situ |
| Tesoura | VWR | 82027-578 | Tesoura de dissecação, ponta afiada, 4¹/? |
| Cloreto de Sódio (Salino) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Estéril, 0.9% |
| Citrato de Sódio, Sal Trissódico, Dihidratado, [Ácido Cítrico, Trissódico Dihidratado] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Hidróxido de Sódio 1N Concentrado, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Tampão de homogeneização de proteína Vaporizador |
| Bella | B00DPX8UBA | ||
| Campo cirúrgico estéril | Busse | 696 | Esterilize antes de usar |
| Lâminas de microscópio Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Seringas | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Seringa estéril, uso único, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ Um espectrofotômetro com WiFi e Qubit™ 4 Fluorômetro | Fisher Scientific | 13-400-525 | Esta configuração vem com o fluorômetro Qubit 4. A quantificação de qubits não é necessária. |
| Adesivo de Tecido | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Tampão de homogeneização de proteínas |
| TRIzol™ Reagente | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolamento |
| TSA Buffer Pack | Cells Diagnostics | 322810 | Usado para diluir o corante de detecção Opal 620 |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Anexado ao vaporizador e aos acessórios do vaporizador |
| Microscópio de fluorescência composto vertical | Olympus | BX61VS | Usado para imagens FISH |
| Vectorshield com DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mídia de montagem de lamínula |
| ViiA™ 7 Sistema de PCR em Tempo Real com Bloco de 384 Poços | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | Este é para detecção de bloco SYBR de 384 poços. TaqMan e/ou blocos menores disponíveis |
| Esmalte Wet n Wild Brilho Selvagem, Protetor de Unhas Transparente, Cor de Unhas | Amazon | C450B | |
| Xilazina 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
Referências
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