O presente protocolo descreve um método eficiente para a aquisição dinâmica e em tempo real de correntes de canal de potássio dependentes de voltagem (Kv) em cardiomiócitos H9c2 usando a técnica de patch-clamp de células inteiras.
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Artigo de método
Registro de Corrente de Potássio Dependente de Voltagem em Cardiomiócitos H9c2 através da Técnica de Patch-Clamp de Células Inteiras
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Os canais de potássio na membrana celular miocárdica desempenham um papel importante na regulação das atividades eletrofisiológicas celulares. Sendo um dos principais canais iônicos, os canais de potássio dependentes de voltagem (Kv) estão intimamente associados a algumas doenças cardíacas graves, como dano miocárdico induzido por drogas e infarto do miocárdio. No presente estudo, a técnica de patch-clamp de células inteiras foi empregada para determinar os efeitos de 1,5 mM de 4-aminopiridina (4-AP, um inibidor do canal de potássio de amplo espectro) e aconitina (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM e 200 μM) sobre a corrente do canal de Kv (IKv) em cardiomiócitos H9c2. Verificou-se que o 4-AP inibiu o I Kv em cerca de 54%, enquanto o efeito inibitório da CA sobre o IKv mostrou uma tendência dose-dependente (sem efeito para 25 μM, taxa inibitória de 30% para 50 μM, taxa inibitória de 46% para 100 μM e taxa inibitória de 54% para 200 μM). Devido às características de maior sensibilidade e precisão, esta técnica promoverá a exploração da cardiotoxicidade e dos efeitos farmacológicos da etnomedicina visando os canais iônicos.
Introdução
Os canais iônicos são proteínas especiais integradas embutidas na bicamada lipídica da membrana celular. Na presença de ativadores, os centros dessas proteínas especiais integradas formam poros hidrofílicos altamente seletivos, permitindo que íons de tamanho e carga apropriados passem de forma passivade transporte 1. Os canais iônicos são a base da excitabilidade celular e da bioeletricidade e desempenham um papel fundamental em uma variedade de atividades celulares2. O coração fornece sangue a outros órgãos através de contrações regulares resultantes de um processo acoplado à excitação-contração iniciado pelos potenciai....
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Protocolo
Os cardiomiócitos de ratos H9c2 obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) foram incubados em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5%. A técnica de patch-clamp de células inteiras foi então empregada para detectar as alterações no IKv em células H9c2 normais e células tratadas com 4-AP- ou AC (Figura 1 e Figura 2).
1. Preparação da solução
- Preparar o meio de cultura de células DMEM contendo 10% de FBS e ....
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Resultados
Este protocolo permitiu o registro do IKv de acordo com os parâmetros estabelecidos na técnica patch-clamp de células inteiras. O IKv foi desencadeado por 150 ms de estímulo de pulso despolarizante de -40 a +60 mV a um potencial de retenção de -60 mV (Figura 3A). O IKv dos cardiomiócitos de ratos H9c2 apareceu pela primeira vez em torno de -20 mV e, em seguida, a amplitude aumentou com mais despolarização. A relação média entre o IKv e o potencial .......
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Discussão
A técnica eletrofisiológica patch-clamp é utilizada principalmente para registrar e refletir a atividade elétrica e as características funcionais dos canais iônicos na membrana celular25. Atualmente, os principais métodos de gravação da técnica patch-clamp incluem a gravação de canal único e a gravação de célula inteira26. Para o modo de célula inteira, o microeletrodo de vidro e a pressão negativa são usados para formar uma vedação de alta resistência entre uma pequena áre.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130113) e do Programa Chave de P&D e Transformação do Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Qinghai (2020-SF-C33).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopiridina | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitina | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
| Amplificador Axônio | Instrumento | MultiClamp 700B | |
| Balança Analítica | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| Vidro borossilicato com filamento (diâmetro externo: 1,5 mm, diâmetro interno: 1,10 mm, comprimento de 10 cm) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
| Placa de cultura de células (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Placa de cultura de células (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Versão 10. 5 | |
| Software Clampfit | Molecular Devices, LLC. | Versão 10. 6. 0. 13 | software de aquisição de dados |
| D-(+)-glicose | Rhawn | RH289133 | |
| Câmera digital | Hamamatsu | C11440 | |
| Digitador | Axon Instrumento | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| meio de águia modificado de Dulbecco (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Soro bovino fetal | Gibco | 2166090RP | |
| Extrator de micropipeta flamejante/marrom | Sutter Instrument | Modelo P-1000 | |
| H9c2 células | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
| KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
| KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
| MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
| MgCl2· 6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
| Micromanipulador | Sutter Instrumento | MP-285A | |
| Microscópio | Olympus | IX73 | |
| Vidro de cobertura do microscópio (20 e vezes; 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
| Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | software amplificador de sinal |
| Software OriginPro 8 | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicilina-Estreptomicina (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| PH medidor | Mettler Toledo | S201K | |
| Solução salina tamponada com fosfato (1x) | Gibco | 8120485 | |
| Tripsina 0,25% (1x) | HyClone | J210045 |
Referências
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. <....
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Reimpressões e permissões
