Artigo de método

Análise da Expressão Gênica em Folículos Humanos

DOI:

10.3791/64807

⸱

17 de fevereiro de 2023

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo que descreve como isolar folículos ovarianos humanos de tecido cortical congelado e descongelado para realizar análises de expressão gênica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ovário é um órgão heterogêneo composto por diferentes tipos celulares. Para estudar os mecanismos moleculares que ocorrem durante a foliculogênese, a localização de proteínas e a expressão gênica podem ser realizadas no tecido fixo. No entanto, para avaliar adequadamente os níveis de expressão gênica em um folículo humano, essa estrutura complexa e delicada deve ser isolada. Assim, um protocolo adaptado descrito anteriormente pelo laboratório de Woodruff foi desenvolvido para separar os folículos (o ovócito e as células da granulosa) de seu ambiente circundante. O tecido cortical ovariano é primeiramente processado manualmente para obter pequenos fragmentos usando duas ferramentas: um fatiador de tecido e um picador de tecido. O tecido é então digerido enzimaticamente com colagenase a 0,2% e DNase a 0,02% por pelo menos 40 min. Esta etapa de digestão é realizada a 37 °C e 5% CO2 e é acompanhada por pipetagem mecânica do meio a cada 10 min. Após a incubação, os folículos isolados são coletados manualmente usando uma pipeta microcapilar calibrada sob magnificação microscópica. Se os folículos ainda estiverem presentes nos pedaços de tecido, o procedimento é completado com microdissecção manual. Os folículos são coletados em gelo em meio de cultura e duas vezes enxaguados em gotículas de solução salina tamponada com fosfato. Este procedimento de digestão deve ser cuidadosamente controlado para evitar a deterioração dos folículos. Assim que a estrutura dos folículos parece estar comprometida ou após um máximo de 90 minutos, a reação é interrompida com uma solução de bloqueio a 4 °C contendo 10% de soro fetal bovino. Um mínimo de 20 folículos isolados (tamanho inferior a 75 μm) deve ser coletado para obter uma quantidade adequada de RNA total após a extração de RNA para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Após a extração, a quantificação do RNA total de 20 folículos atinge um valor médio de 5 ng/μL. O RNA total é então retrotranscrito em cDNA, e os genes de interesse são posteriormente analisados usando RT-qPCR.

Introdução

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O ovário é um órgão complexo composto por unidades funcionais e estruturais, incluindo os folículos dentro do córtex e o estroma. A foliculogênese, processo de ativação, crescimento e maturação dos folículos de um estado quiescente primordial para um folículo maduro capaz de ser fecundado e suportar o desenvolvimento embrionário inicial, é amplamente estudada empesquisa1. Desvendar os mecanismos que impulsionam esse fenômeno poderia melhorar o cuidado da fertilidade para as mulheres2. Análises em tecido humano fixado permitem avaliar a expressão proteica e a localização gênica dentro das unidades funcionais do ovário 3,4. No entanto, técnicas específicas são necessárias para dissociar os folículos do córtex circundante para avaliar com precisão os níveis de expressão gênica dentro dos folículos ovarianos. Assim, em estudo anterior, uma técnica de isolamento de folículos foi desenvolvida para permitir a análise da expressão gênica diretamente da unidade funcional doovário5. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidas, como digestão enzimática e/ou isolamento mecânico, bem como microdissecção por captura a laser, que permitem o isolamento do folículo dentro de um pedaço de tecido 6,7,8,9. O isolamento de folículos é amplamente utilizado, seja com tecido ovariano humano ou animal, para avaliar o perfil de expressão gênica de folículos em todas as fases do desenvolvimento10,11,12. No entanto, um procedimento de isolamento ideal deve levar em conta a frágil estrutura do folículo dentro do córtex denso e, portanto, deve ser realizado com cuidado para evitar qualquer dano7. Este manuscrito descreve um procedimento, adaptado de um protocolo descrito pelo laboratório de Woodruff, para isolar folículos humanos do córtex ovariano congelado descongelado para realizar análises de expressão gênica13.

O primeiro passo do isolamento do folículo ovariano do tecido humano congelado é o procedimento de descongelamento. Esse processo é realizado com base no protocolo clínico utilizado para a enxertia de tecido ovariano criopreservado, conforme descrito anteriormente14,15. O processo visa remover os agentes crioprotetores enxaguando o córtex ovariano em concentrações decrescentes do meio. Em seguida, o tecido é fragmentado antes do isolamento enzimático e mecânico para recuperação dos folículos. Folículos em diferentes estágios podem ser distinguidos usando um estereomicroscópio com alta magnificação e óptica de boa qualidade, a fim de isolar os de interesse. Cada folículo isolado é medido usando uma régua integrada ao microscópio, e os folículos podem ser agrupados de acordo com seu estágio de desenvolvimento: folículos primordiais (30 μm), folículos primários (60 μm), folículos secundários (120-200 μm) e folículos antrais (>200 μm)16. Uma classificação posterior pode ser realizada de acordo com a morfologia dos folículos: os folículos primordiais têm uma camada de células da granulosa (GCs) achatadas, os folículos primários têm uma camada de GCs cuboidais, os folículos secundários têm pelo menos duas camadas de GCs cuboidais e a presença de uma cavidade entre os GCs caracteriza o estágio antral. Quando os folículos de interesse são selecionados, a extração de RNA é realizada. A quantidade e a qualidade do RNA são avaliadas antes da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) (Figura 1).

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Protocolo

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Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Erasme (Bruxelas, Bélgica). A paciente incluída neste protocolo foi submetida à criopreservação de tecido ovariano (COT) para preservação da fertilidade antes da exposição à quimioterapia em 2000. A paciente assinou o termo de consentimento livre e esclarecido para doação de seu tecido residual congelado para pesquisa ao final do período de armazenamento.

1. Descongelamento do tecido ovariano criopreservado

  1. Prepare uma placa de 6 poços contendo cinco soluções de descongelamento. O primeiro poço contém 5 mL de solução crioprotetora composta de meio Leibovitz-15, sacarose 0,1 mol/L, dimetilsulfóxido (DMSO) 1,5 mol/L e albumina sérica humana (HSA) a 1%. Os poços seguintes contêm 5 mL de meio Leibovitz-15 com concentrações decrescentes de crioprotetor: 1 mol/L, 0,5 mol/L e 2 x 0 mol/L DMSO.
    NOTA: A solução crioprotetora pode diferir de acordo com o protocolo utilizado na clínica de fertilidade.
  2. Remova um frasco para injetáveis contendo um fragmento cortical ovariano de azoto líquido em conformidade com as regras de segurança (luvas criogénicas, óculos de proteção e sapatos fechados) e mantenha o tubo à temperatura ambiente (TR) durante 30 s.
  3. Mergulhe o frasco para injetáveis em água bidestilada durante 2 minutos em RT com agitação suave antes de abrir o frasco para injetáveis sob um capuz vertical e transferi-lo diretamente para o primeiro poço da placa de 6 poços (sobre gelo).
  4. Transfira o fragmento sucessivamente para cada poço da placa de 6 poços, com cada um contendo concentrações decrescentes de crioprotetor em 5 mL de meio Leibovitz-15. Agitar suavemente o tecido em cada meio por 5 min (sobre gelo).

2. Isolamento dos folículos

NOTA: Todos os experimentos são conduzidos usando materiais livres de RNase e sob uma capa vertical.

  1. Transferir o tecido descongelado para uma placa de Petri quadriculada de 2 mm preenchida com 10 mL de meio de dissecção (meio Leibovitz-15, piruvato de sódio [2 mmol/L], L-glutamina [2 mmol/L], HSA [0,3%], penicilina G [30 μg/mL] e estreptomicina [50 μg/mL]). Ajuste o tamanho do tecido com um bisturi, se necessário.
    OBS: Dependendo do protocolo clínico, o tamanho do tecido congelado pode variar de 8 mm x 4 mm x 1 mm a 4 mm x 2 mm x 1 mm. Para esse protocolo, foram utilizadas duas tiras de 4 mm x 2 mm x 1 mm.
  2. Empilhar os três pedaços do fatiador de tecido, colocar o fragmento entre os dois blocos e cortar o fragmento ao meio usando uma lâmina, deslizando através dos blocos para obter dois fragmentos de 0,5 mm de espessura.
  3. Use o cortador de tecido para cortar o fragmento e obter pedaços menores. Se necessário, corte as peças restantes manualmente com um bisturi até que o tecido esteja totalmente quebrado.
  4. Transferir o tecido fragmentado para uma placa de Petri quadriculada preenchida com 7 mL de meio de digestão (meio de cultura [meio McCoy's 5A, 3 mmol/L de glutamina, 0,1% HSA, 30 μg/mL de penicilina G, 50 μg/mL de estreptomicina, 2,5 μg/mL de transferrina, 4 ng/mL de selênio e 50 μg/mL de ácido ascórbico] suplementado com 0,2% de colagenase e 0,02% de DNase).
  5. Coloque o prato na incubadora a 5% CO2 e 37 °C. A cada 10 min, retire a placa de Petri da incubadora e lave o tecido pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL.
  6. Após 45 min de incubação no meio de digestão, colocar a placa sob um estereomicroscópio com amplitude de 5x-6,3x e recuperar os folículos usando uma pipeta microcapilar. Selecione os folículos de interesse e isole-os sugando-os com uma pipeta bucal.
    OBS: A pipetagem bucal deve ser realizada com cuidado para evitar a perda de material na tubulação e contaminação.
  7. Se os folículos permanecerem presos em um pedaço do córtex, isole-os mecanicamente com duas seringas de 27 G, arrancando o córtex com a ponta das seringas para liberar os folículos do estroma.
    NOTA: Não toque nos folículos com as seringas para evitar danificá-los.
  8. Transferir os folículos com o microcapilar em uma placa de 4 poços contendo gotas de 15 μL do meio de cultura calibrado coberto por 500 μL de cultura de óleo (1 a 10 folículos por gota). Essa etapa mantém a viabilidade do folículo durante o processo de coleta. No final do procedimento, lave os folículos duas vezes por 5 s cada vez em duas gotas de 15 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) cobertas por 500 μL de cultura de óleo (sobre gelo).
  9. Coletar 20 folículos com uma quantidade mínima de PBS usando a pipeta bucal (máximo de 10 μL) em um tubo vazio e manter o tubo sobre gelo.
    NOTA: Para a estabilidade do RNA, é crucial executar a etapa 2.8 e a etapa 2.9 no gelo. Cerca de 20 folículos (<75 μm) são necessários para ter RNA suficiente para RT-qPCR padrão (SYBR Green).
  10. Após um máximo de 90 min de incubação no meio de digestão, interromper a reação enzimática adicionando à placa de Petri um excesso de solução bloqueadora fria (4 °C) (7,5 mL) composta de meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB).
    NOTA: A solução de bloqueio pode ser adicionada assim que o experimentador observar folículos grudados na placa ou folículos danificados (forma assimétrica ou folículos de cor mais escura). Recomenda-se realizar o isolamento do folículo dentro de um período máximo de 2,5 h para evitar danos foliculares e realizar a extração de RNA imediatamente após o isolamento.

3. Extração de RNA

NOTA: A extração de RNA é realizada seguindo as instruções fornecidas com um kit de extração de RNA, adaptando os volumes de eluição.

  1. Suspender os folículos isolados adicionando 100 μL da solução de lise fornecida com o kit de extração de RNA ao tubo contendo os folículos sob uma capa química e vórtice em alta velocidade (2.500 rpm/min) para quebrar a estrutura dos folículos. Adicionar 50 μL de etanol (100%) ao tubo e agitar brevemente a alta velocidade.
    NOTA: Como o tampão de lise contém 2-mercaptoetanol e ácido tiocianico, esta etapa deve ser executada com cautela sob um capuz químico.
  2. Transferir o volume total do tubo (aproximadamente 160 μL) para um conjunto de cartucho de microfiltro composto por uma coluna e um tubo de recolha e centrifugar-o durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Lavar a coluna com 180 μL da solução de lavagem 1, fornecida com o kit, e centrifugar o tubo durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C.
  3. Adicionar 180 μL de solução de lavagem 2/3, fornecida com o kit, à coluna e centrifugar durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Execute esta etapa duas vezes. Centrifugar o tubo uma última vez por 1 min para secar o filtro e colocar um novo tubo de coleta sob o cartucho.
  4. Realizar a eluição dos ácidos nucleicos em duas etapas:
    1. Primeiro, adicionar 8 μL de solução de eluição quente (75 °C) ao filtro, aguardar 1 min em RT e centrifugar durante 30 s a 16,363 x g a 4 °C.
    2. Repetir este passo com 7 μL de solução de eluição.
      NOTA: O tubo que contém os ácidos nucleicos eluídos deve ser mantido no gelo. Para evitar a contaminação do DNA, uma etapa suplementar de degradação do DNA é altamente recomendada- etapa 3.5.
  5. Incubar o tubo com 2 UI de DNase e 1x tampão DNase durante 20 min a 37 °C. Bloquear a atividade enzimática com o reagente de inativação da 1/10 DNase por 2 min em TR.
  6. Centrifugar o tubo durante 1,5 min a 16,363 x g a 4 °C. Por fim, colete a suspensão contendo o RNA e transfira-o para um novo tubo.
  7. Avaliar a quantidade de RNA presente na amostra utilizando um espectrofotômetro (software NanoDrop 2000 > Ácido Nucleico > RNA). Use 1 μL de solução de eluição como um branco e meça a quantidade de RNA extraída de folículos isolados com 1 μL de solução.
  8. Verifique a relação 260/280 para a pureza do RNA (em torno de 2,0). Armazenar a amostra a −80 °C ou retrotranscrevê-la diretamente para realizar RT-qPCR.
    NOTA: Para avaliar a integridade do RNA, a amostra pode ser processada com um sistema de eletroforese automatizado de alta resolução antes ou depois do congelamento a -80 °C. Neste trabalho, após retrotranscrição, foi realizada RT-qPCR com o seguinte ciclo:
    Estágio de espera com 20 s a 50 °C e 10 min a 95 °C
    40 ciclos de PCR com 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C
    Estágio da curva de fusão com 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C, 30 s a 95 °C e 15 s a 60 °C

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Resultados

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Usando este procedimento de isolamento, o experimentador pode recuperar folículos do ambiente estromal para realizar análises específicas de expressão gênica. Com base no tamanho e morfologia dos folículos, é possível diferenciar os diferentes estágios da foliculogênese. O experimentador pode selecionar folículos de interesse de acordo com seu tamanho usando uma pipeta microcapilar adaptada. Usando um microcapilar de no máximo 75 μm, é possível discriminar folículos primordiais e primários de folículos secundários, antra...

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Discussão

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A criopreservação do tecido ovariano é uma abordagem promissora para a preservação da fertilidade de pacientes com câncer. Na clínica, o tecido cortical descongelado é enxertado de volta na paciente após a remissão, permitindo a retomada da função ovariana e da fertilidade19,20. Além do uso clínico, fragmentos ovarianos residuais também podem ser doados para pesquisa ao final do período de armazenamento para estudar os mecanismos reguladores da foliculogênese. Al...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Excelência da Ciência (EOS) (ID: 30443682). I.D. é pesquisador associado do Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Petri gradeada de 2 mmCorning430196
2100 Instrumento BioanalisadorAgilentG2939BA
2100 SoftwareExpert Agilentversão B.02.08.SI648
Placa de 4 poçosSigma AldrichD6789
Placa de 6 poçosCarl Roth  EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513
Ácido ascórbicoSigma AldrichA4403
Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilaresSigma AldrichA5177
CentrífugaEppendorf5424R
Colagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript transcriptase reversaPromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-GlutaminaSigma AldrichG7513
McCoy' s 5A + bicarbonato + HepesLifeTechnologies12330-031
Cortador de tecidos McIlwainStoelting51350
Microcapilary RI EZ-Tips 200 µ mCooperSurgical7-72-2200/1
Microcapilar RI EZ-Tips 75 µ mCooperSurgical7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c software operacionalThermoFisherversão 1.6
Espectrofotômetro NanoDropThermoFisher2000/2000c
Penicilina GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR green master mixThermoFisherA46109
Primers: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primers: HPRTF: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primers: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
QPCR EM TEMPO REAL Quantstudio 3ThermoFisherA33779
Kit de isolamento de RNA total RNAqueous-microThermoFisherAM1931
SelênioSigma AldrichS9133
Piruvato de sódioSigma AldrichS8636
EstereomicroscópioNikonSMZ800
Sulfato de estreptomicinaSigma AldrichS1277
SacaroseSigma AldrichS1888
Thermo Scientific Forma Série II  com camisa de água CO2  incubadorasThermoFisher3110
Thomas Stadie-Riggs fatiador de tecidosThomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
10652202001

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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