Aqui, um protocolo para a formulação de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulam RNAm que codifica a luciferase do vagalume é apresentado. Esses LNPs foram testados quanto à sua potência in vitro em células HepG2 e in vivo em camundongos C57BL/6.
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Artigo de método
Testando a Eficiência In Vitro e In Vivo de Nanopartículas de RNAm-Lipídios Formuladas por Mistura Microfluídica
Neste artigo
Resumo
Resumo
As nanopartículas lipídicas (LNPs) atraíram atenção generalizada recentemente com o desenvolvimento bem-sucedido das vacinas de mRNA COVID-19 pela Moderna e Pfizer/BioNTech. Essas vacinas demonstraram a eficácia da terapêutica mRNA-LNP e abriram as portas para futuras aplicações clínicas. Em sistemas de mRNA-LNP, os LNPs servem como plataformas de entrega que protegem a carga de mRNA da degradação por nucleases e mediam sua entrega intracelular. Os LNPs são tipicamente compostos por quatro componentes: um lipídio ionizável, um fosfolipídio, colesterol e um conjugado de polietilenoglicol (PEG) ancorado a lipídios (lipid-PEG). Aqui, LNPs encapsulando mRNA que codificam a luciferase de vagalumes são formulados por mistura microfluídica da fase orgânica contendo componentes lipídicos do LNP e da fase aquosa contendo mRNA. Esses mRNA-LNPs são então testados in vitro para avaliar sua eficiência de transfecção em células HepG2 usando um ensaio baseado em placa bioluminescente. Além disso, os mRNA-LNPs são avaliados in vivo em camundongos C57BL/6 após uma injeção intravenosa através da veia lateral da cauda. A imagem de bioluminescência de corpo inteiro é realizada usando um sistema de imagem in vivo . Resultados representativos são mostrados para as características do RNAm-LNP, sua eficiência de transfecção em células HepG2 e o fluxo luminescente total em camundongos C57BL/6.
Introdução
Nanopartículas lipídicas (LNPs) têm se mostrado promissoras nos últimos anos no campo da terapia gênica não viral. Em 2018, a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos aprovou a primeira terapêutica de RNA de interferência (RNAi), Onpattro by Alnylam, para o tratamento da amiloidose transtirretina hereditária 1,2,3,4. Este foi um passo importante para nanopartículas lipídicas e terapias baseadas em RNA. Mais recentemente, a Moderna e a Pfizer/BioNTech receberam aprovações da FDA para suas vacinas de mRNA-LNP contra o SARS-CoV-2
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Protocolo
NOTA: Sempre mantenha as condições livres de RNase ao formular mRNA-LNPs, limpando as superfícies e equipamentos com um descontaminante de superfície para RNases e DNA. Use apenas pontas e reagentes sem RNase.
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade da Pensilvânia e um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Pensilvânia.
1. Preparação da pré-formulação
- Encha um copo limpo de 4 L com 200-300 mL de solução salina fresca tamponada com....
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Resultados
Os mRNA-LNPs foram formulados usando um instrumento microfluídico que possuía um diâmetro hidrodinâmico médio de 76,16 nm e um índice de polidispersidade de 0,098. O pKa dos RNAm-LNPs foi encontrado em 5,75 através da realização de um ensaio TNS18. A eficiência de encapsulação para esses mRNA-LNPs foi calculada em 92,3% usando o ensaio de fluorescência modificado e a equação 4.4. A concentração total de RNA utilizada para o tratamento celular e dosagem em anima.......
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Discussão
Com esse fluxo de trabalho, uma variedade de mRNA-LNPs pode ser formulada e testada quanto à sua eficiência in vitro e in vivo. Lipídios ionizáveis e excipientes podem ser trocados e combinados em diferentes razões molares e diferentes razões de peso de lipídios ionizáveis para RNAm para produzir RNAm-LNPs com diferentes propriedades físico-químicas22. Aqui, formulamos C12-200 mRNA-LNPs com uma razão molar de 35/16/46,5/2,5 (lipídio ionizável:lipídio auxiliar:colesterol:lipídio-P.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
M.J.M. reconhece o apoio de um Prêmio Novo Inovador do Diretor do National Institutes of Health (NIH) dos EUA (DP2 TR002776), um Prêmio de Carreira do Fundo Burroughs Wellcome na Interface Científica (CASI), um prêmio CAREER da Fundação Nacional de Ciência dos EUA (CBET-2145491) e financiamento adicional dos Institutos Nacionais de Saúde (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 e NIDDK R01 DK123049).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0.1 M Ácido Clorídrico | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μ m Filtros de seringa | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Seringa de ponta deslizante | BD | 309659 | |
| 1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (sal de amônio) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Tubos Cônicos | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 prova de etanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Agulhas | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Seringas descartáveis com pontas Luer-Lok | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Diálise | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Placa de Fundo Preto de Parede Preta de 96 Poços | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| Placa de Fundo Branco/Transparente de 96 Poços, Superfície TC | Thermo Scientific | 165306 | |
| Amônio, 1 Quilograma | Research Products International | 631-61-8 | |
| Citrato de amônio dibásico | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Seringa estéril, uso único, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Lipídio ionizável | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL / 6 Camundongos | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Colesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Cubetas descartáveis | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferina, Sal de Potássio | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, alta glicose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Seringas de Insulina Exel - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Soro Fetal Bovino | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N / A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N / A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Promega | E4550 | ||
| NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - Pacote com 100 | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, livre de RNase | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Tampão de Citrato, (Citrato 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Descontaminante de Superfície | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Cloreto de sódio | Sigma | 7647-14-5 | |
| Hidróxido de sódio | Sigma | 1310-73-2 | |
| Fosfato de sódio | Sigma | 7601-54-9 | |
| Reagente TNS (sal de sódio de ácido 6-(p-Toluidino) -2-naftalenossulfônico) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
Referências
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran ....
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Reimpressões e permissões
