Artigo de método

Estratégias de triagem de moléculas pequenas, desde a identificação do eletrodo até a validação

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DOI:

10.3791/64811

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20 de janeiro de 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

Neste artigo

Resumo

ARTIGOS DISCUTIDOS:

Festa, F., Labaer, J. Triagem de inibidores de quinase em microarrays de proteínas humanas automontadas. Jornal de Experimentos Visualizados. 152, e59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. Ensaios de atividade baseados em RMN para determinar a inibição do composto, valores de IC50, atividade artifactual e atividade de células inteiras de ribohidrolases de nucleosídeos. Jornal de Experimentos Visualizados. 148, e59928 (2019).

Gao, S. et al. Um ensaio de alto rendimento para a previsão de toxicidade química por perfil fenotípico automatizado de Caenorhabditis elegans. Jornal de Experimentos Visualizados. 145, e59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Usando imagens de alto conteúdo para quantificar o envolvimento do alvo em células aderentes. Jornal de Experimentos Visualizados. 141, e58670 (2018).

Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Um ensaio de luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise da protease PCSK9 de renovação única. Jornal de Experimentos Visualizados. 138, e58265 (2018).

Sullivan, C. et al. Usando modelos de peixe-zebra de infecções pelo vírus influenza A humano para rastrear drogas antivirais e caracterizar as respostas das células imunes do hospedeiro. Jornal de Experimentos Visualizados. 119, e55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Avaliação da resistência aos inibidores da tirosina quinase por uma interrogação das vias de transdução de sinal por matrizes de anticorpos. Jornal de Experimentos Visualizados. 139, e57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Vendedores, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. Uma adaptação de rendimento semi-alto do ensaio ATPase acoplado a NADH para triagem de inibidores de moléculas pequenas. Jornal de Experimentos Visualizados. 150, e60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Desenvolvimento de inibidores de interações proteína-proteína por meio de REPLACE: Aplicação ao projeto e desenvolvimento de inibidores de CDK competitivos não-ATP. Jornal de Experimentos Visualizados. 104, e52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identificação de mediadores da sinalização do receptor de células T por meio da triagem de bibliotecas de inibidores químicos. Jornal de Experimentos Visualizados. 143, e58946 (2019).

Takakusagi, Y. Biopanning de alto rendimento baseado em biossensores e estratégia de análise de bioinformática para a validação global de interações medicamento-proteína. Jornal de Experimentos Visualizados. 166, e61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. Perfil celular de alto rendimento de compostos de degradação de proteínas direcionados usando linhas celulares HiBiT CRISPR. Jornal de Experimentos Visualizados. 165, e61787 (2020).

Editorial

A revolução genômica resultou em uma vasta quantidade de conhecimento sobre a associação entre perturbação genética e diferentes fenótipos de doenças1. Isso levou à anotação de inúmeras proteínas como potenciais alvos de drogas e estimulou o interesse na descoberta e desenvolvimento de compostos que inibem esses alvos2. Nesse contexto, diferentes estratégias de triagem surgiram como abordagens importantes para a descoberta de compostos de sucesso, validação de alvos, medição de afinidades de ligação, seletividade, toxicidade e engajamento de alvos na célula, bem como reatividade de compostos, estabilidade e propriedades farmacocinéticas. Esta coleção captura alguns dos avanços metodológicos nesta área com o objetivo de mostrar uma infinidade de estratégias que podem ser usadas para rastrear e avaliar a atividade bioquímica e / ou biológica de pequenas moléculas.

As proteínas quinases representam uma grande família de enzimas com mais de 500 membros. Essas enzimas são reguladoras-chave de todos os processos celulares, e seu mau funcionamento tem sido associado a inúmeras doenças3. Portanto, eles têm sido o foco de intenso interesse na descoberta de medicamentos e, por extensão, no desenvolvimento de metodologias. Assim, quatro artigos desta coleção relatam avanços nesse espaço. Festa et al. descrevem uma plataforma de triagem para descoberta de inibidores de quinase que usa matrizes de proteínas programáveis de ácido nucleico auto-montadas (NAPPA)4. Essas matrizes exibem quinases humanas de comprimento total e permitem a triagem multiplexada de compostos em uma grande coleção de quinases, permitindo não apenas a identificação de acertos, mas também a seletividade de perfil. Tieman et al. descrevem um método baseado em microarray de fosfoanticorpos desenvolvido para rastrear mudanças em toda a célula no status de fosforilação como uma leitura da atividade do inibidor da quinase5. Isso pode levar a insights sobre a natureza das vias que se tornaram resistentes à inibição, que é um parâmetro importante relevante para a compreensão da resposta e eficácia dos medicamentos. Chen et al. descrevem um ensaio de citometria de fluxo para triagem de coleções de inibidores de quinase para identificar compostos que afetam a sinalização do receptor de células T (TCR)6. Essa estratégia levou à rápida identificação de quinases envolvidas na sinalização do TCR, indicando seu potencial como alvos para o desenvolvimento de drogas imunoterapêuticas. Por fim, a atividade de muitas quinases é regulada por meio de interações proteína-proteína (PPIs), sugerindo que os compostos que têm como alvo esses IBPs podem ser de interesse. Nandha Premnath et al. descrevem um método chamado REPLACE (substituição por alternativas de ligantes parciais usando enriquecimento computacional) que pode ser usado para desenvolver PPIs competitivos não-ATP de quinases, convertendo características de ligantes peptídicos em pequenas moléculas que envolvem a mesma superfície de ligação7.

Além das quinases, muitas outras enzimas desempenham papéis na doença e têm sido buscadas na descoberta de medicamentos. Portanto, métodos otimizados para outras enzimas além das quinases também são de interesse. Por exemplo, Stockman et al. descrevem ensaios de atividade baseados em espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) para descobrir e avaliar inibidores de ribohidrolases de nucleosídeos do parasita Trichomonas vaginalis8. Esses ensaios também podem ser usados para a determinação dos valores de IC50 . Para rastrear inibidores de ATPase, Radnai et al. desenvolveram um método de triagem de rendimento semi-alto que usa um formato de ensaio enzimático acoplado envolvendo duas enzimas (piruvato quinase e lactato desidrogenase) que, em última análise, traduz a atividade da ATPase em fluorescência intrínseca do dinucleotídeo nicotinamida adenina (NADH) como uma leitura9. Ao contrário de todas as enzimas descritas até agora que são processivas e catalisam várias etapas, a pró-proteína convertase subtilisina / kexina tipo 9 (PCSK9) é uma protease de renovação única que é autoinibida por seu substrato. Isso torna a triagem de inibidores de PCSK9 desafiadora, e Chorba et al. descrevem um método baseado em células de alto rendimento que liga a atividade de clivagem de PCSK9 à atividade de luciferase secretada como uma leitura, permitindo assim a triagem de inibidores10.

Além de encontrar compostos que inibem a atividade de vários alvos, ensaios que confirmam que o composto envolve seu alvo pretendido nas células também são de grande interesse. Axelsson et al. descrevem uma estratégia para validar o engajamento do alvo em células aderentes com base na combinação de imagens de alto conteúdo por anticorpos imunofluorescentes e um ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA)11. Este ensaio usa um desafio de calor isotérmico para células tratadas com uma grande coleção de compostos para identificar compostos estabilizadores. Um método que pode avaliar o envolvimento do alvo e a atividade de moléculas degradadoras, desenvolvido por Riching et al., usa a tecnologia de marcação HiBiT / LgBiT para produzir uma proteína luminescente e monitorar os parâmetros de degradação por meio de uma diminuição na luminescência12. Por fim, Takakusagi et al. descrevem um método para validar interações proteína-droga que se baseia no uso de exibições de peptídeos baseados em fagos para rastrear a ligação entre motivos peptídicos de ligação a drogas e pequenas moléculas13. A tela de exibição de peptídeos é combinada com a análise de bioinformática para validar a ligação do alvo.

Outra camada de validação de pequenas moléculas é a caracterização de seus efeitos em modelos animais. Esta coleção inclui dois desses métodos, um que usa modelos de peixe-zebra (Danio rerio) de infecção pelo vírus da influenza A humana para avaliar a eficácia de compostos com atividade antiviral, bem como a resposta imune do hospedeiro14, e outro que emprega Caenorhabditis elegans como modelo para traçar o perfil da toxicidade do composto15. Ambos os estudos destacam a necessidade de métodos otimizados que possam avaliar a eficácia e a toxicidade in vivo.

Em conclusão, a descoberta e o desenvolvimento de medicamentos são processos formidáveis com inúmeros gargalos, desafios e uma alta probabilidade de falha. Além disso, a carga contínua de doenças, seja na área de doenças infecciosas, onde o número de patógenos resistentes a medicamentos tem crescido a um ritmo alarmante, ou nas áreas de aumento da prevalência de doenças crônicas e doenças associadas ao envelhecimento da população, exige nossa atenção e ação focadas. Esta coleção destaca vários métodos que visam acelerar a descoberta, validação e caracterização de medicamentos. No futuro, esperamos ver mais inovações neste espaço, especialmente aquelas destinadas a melhorar o rendimento da triagem, aumentar a diversidade de bibliotecas químicas e desenvolver modelos in vivo compatíveis com triagem de alto rendimento (HTS). Além disso, fluxos de trabalho que fornecem uma visão holística de potência, seletividade, especificidade, eficácia e toxicidade em uma escala mais rápida e menor podem ser especialmente facilitadores.

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Referências

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

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