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Sistema de detecção de vírus de DNA baseado em RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e aprendizado profundo

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DOI:

10.3791/64833

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10 de maio de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Precision Medicine and Healthcare, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, 2Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo que combina amplificação da polimerase recombinase com um sistema CRISPR/Cas12a para detecção de traços de vírus de DNA e constrói microscopia portátil para smartphone com uma classificação assistida por inteligência artificial para detecção de vírus de DNA no local de atendimento.

Resumo

Relatamos um sistema de detecção de vírus de DNA rápido, fácil de implementar, altamente sensível, específico de sequência e ponto de atendimento (POC), que combina amplificação da polimerase recombinase (RPA) e sistema CRISPR/Cas12a para detecção de vestígios de vírus de DNA. O DNA alvo é amplificado e reconhecido por RPA e CRISPR/Cas12a separadamente, o que desencadeia a atividade de clivagem colateral de Cas12a que cliva um repórter de DNA rotulado como fluoróforo-supressor e generaliza a fluorescência. Para detecção de POC, a microscopia portátil de smartphone é construída para tirar imagens fluorescentes. Além disso, modelos de deep learning para classificação binária de amostras positivas ou negativas, alcançando alta precisão, são implantados no sistema. O vírus 3 da rã (FV3, gênero Ranavirus, família Iridoviridae) foi testado como exemplo para este sistema de detecção de POC de vírus de DNA, e os limites de detecção (LoD) podem atingir 10 aM em 40 min. Sem operadores qualificados e instrumentos volumosos, a classificação portátil e em miniatura RPA-CRISPR/Cas12a-SPM com inteligência artificial (IA) mostra grande potencial para detecção de vírus de DNA POC e pode ajudar a prevenir a propagação de tais vírus.

Introdução

Nos últimos anos, epidemias de doenças infecciosas causadas por diferentes vírus têm ocorrido com frequência, incluindo a epidemia da doença do vírus Ebola (EVD) em 20141 e 20182, a Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS) em 20153, a epidemia da doença do vírus Zika em 20154, a doença do Coronavírus 2019 (COVID-19) causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2)5 e a continuação da varíola dos macacos causada pelo vírus da varíola dos macacos (MKPV) em 20226. Esses surtos repentinos de doenças infecciosas epidêmicas causam um grande número de mortes e trazem enormes perdas econômicas e agitação social. Um sistema de detecção rápido e preciso é urgentemente necessário para diagnosticar rapidamente a infecção e evitar a propagação do vírus.

Recentemente, repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) e proteínas associadas a CRISPR (Cas) ganharam atenção mundial e mostraram resultados promissores na detecção de ácidos nucleicos 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . A proteína CRISPR/Cas12a, guiada pelo RNA CRISPR (crRNA), liga-se e cliva o DNA alvo. Essa atividade leva à liberação de DNA de fita simples inespecífico (ssDNA), conhecido como transclivagem, e pode ser utilizada para aumentar o sinal de detecção de ácido nucleico. Alguns métodos tradicionais de detecção, como reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) são complicados, demorados e caros para detecção no local de atendimento (POC). Nosso trabalho anterior desenvolveu com sucesso um sistema de detecção automatizado, integrado e econômico para o vírus da peste suína africana (ASFV) baseado na tecnologia CRISPR/Cas12a. Neste sistema, atingimos um limite de detecção de 1 pM em um período de 2 horas sem a necessidade de amplificação. O sistema CRISPR/Cas12a e a amplificação da polimerase recombinase (RPA) são combinados para melhorar a sensibilidade e a especificidade para a detecção de traços de DNA. Comparado com outras técnicas de amplificação isotérmica, o RPA é simples em design e conveniente em operação, pois tem um tempo de reação mais curto sem equipamentos sofisticados de controle de temperatura.

Para a detecção de patógenos por POC, instrumentos como microscopia de smartphone (SPM), fluorímetro portátil ou tiras de fluxo lateral são desenvolvidos para as leituras dos resultados 16,17,18. O SPM captura imagens por meio de uma câmera e as carrega em alguns aplicativos móveis para análise rápida de dados. Essa microscopia produz um sistema de aquisição de sinal portátil, barato, miniado e com alta sensibilidade e tem mostrado vantagens na detecção de patógenos como o H5N1, o vírus Zika e o SARS-CoV-2 19,20. Portanto, construímos um SPM portátil para capturar os sinais de fluorescência acionados pela detecção RPA-CRISPR/Cas12a do vírus de DNA alvo. A sonda repórter ssDNA ligando um fluoróforo e um supressor será clivada quando o CRISPR/Cas12a reconhecer o vírus de DNA alvo, e a fluorescência emitida pelo fluoróforo puder ser capturada pelo SPM.

Em comparação com o software profissional geralmente usado para obter as informações de resultados das imagens de fluorescência do SPM21, alguns especialistas usam aprendizado de máquina e aprendizado profundo para quantificar as concentrações de DNA do vírus após obter imagens de fluorescência22, o que é mais demorado. Quando se trata de classificar imagens médicas, as redes neurais convencionais (CNNs) são frequentemente usadas para aprender recursos das imagens pixeladas brutas de maneira ponta a ponta 23,24,25,26. Modelos populares de aprendizado profundo baseados em CNN, como AlexNet, DenseNet-121 e EfficientNet-B7, foram aplicados com sucesso neste campo27,28. No entanto, a obtenção de grandes conjuntos de dados em domínios específicos pode ser desafiadora, necessitando de transferência de aprendizado29,30. Essa abordagem pré-treina um modelo de aprendizado profundo com um grande conjunto de dados, e o modelo pré-treinado é usado como ponto de partida para uma nova tarefa com um pequeno conjunto de dados. Essa técnica pode reduzir a necessidade de grandes conjuntos de dados, combater o overfitting e reduzir o tempo de treinamento31. Aqui, usamos modelos de aprendizado profundo com aprendizado de transferência para a classificação binária das imagens de fluorescência das amostras positivas e negativas.

Neste método, combinamos RPA e o sistema CRISPR/Cas12a para a detecção de vestígios de vírus de DNA. O DNA alvo é amplificado e reconhecido por RPA e CRISPR/Cas12a separadamente, o que desencadeia a atividade de clivagem colateral de Cas12a que cliva um repórter de DNA rotulado como fluoróforo-supressor e generaliza a fluorescência. Construímos um SPM portátil para obter as imagens fluorescentes para detecção de POC e desenvolvemos modelos de aprendizado profundo para classificação binária. O esquema do sistema de detecção de POC construído é mostrado na Figura 1. Sem operadores qualificados e instrumentos volumosos, a classificação assistida por RPA-CRISPR/Cas12a-SPM com inteligência artificial (IA) mostra grande potencial para detecção de vírus de DNA POC.

figure-introduction-1
Figura 1: O esquema do sistema de detecção RPA-CRISPR/Cas12-SPM junto com a classificação de IA para imagens coletadas. Os ácidos nucléicos de amostras derivadas de animais são liberados por PINDBK. O DNA alvo do vírus é amplificado e reconhecido especificamente pelo sistema RPA-CRISPR/Cas12a. O CRISPR/Cas12a se liga ao crRNA e o complexo Cas12a-crRNA se liga ao DNA alvo, o que desencadeia a clivagem colateral do CRISPR/Cas12a nas sondas repórter do ssDNA. O fluoróforo no repórter é liberado e a fluorescência é detectada por um leitor de placas comercializado ou pelo SPM que construímos. Três modelos diferentes de aprendizado profundo, incluindo AlexNet, DenseNet-121 e EfficientNet-B7 com aprendizado de transferência, são usados para classificar as imagens de fluorescência. Essa figura é reutilizada com permissão de Lei et al.35. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Processamento de amostras

  1. Veja o Frog Virus 3 (FV3, gênero Ranavirus, família Iridoviridae), um vírus de DNA de fita dupla. Selecione o gene do capsídeo principal (mcp) como alvo para a detecção de FV3, pois é altamente conservado e geralmente considerado como alvo para detecção de ranavírus. A sequência alvo selecionada é mostrada na Tabela 1.
    NOTA: O Frog Virus 3 é tomado como exemplo neste protocolo.
  2. Para a preparação de fragmentos de DNA alvo, use fragmentos de DNA do gene mcp de FV3 e Vírus de Necrose Infecciosa do Baço e Rim (ISKNV, outro Ranavirus).
    NOTA: Neste estudo, os fragmentos de DNA alvo foram obtidos comercialmente de uma empresa listada na Tabela de Materiais. Eles são considerados o alvo e o controle da detecção subsequente.
NomeSeqüenciar
FV3 MCPNTS: 5' ... gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGTCGGCGTtcccaggtcgg... 3' (240 bp)
TS: 5' ... ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgcccgaaagc... 3' (240 bp)
ISKNV MCPNTS: 5' ... ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg... 3' (231 bp)
TS: 5' ... ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAATtggcatggcc... 3' (231 bp)

Tabela 1: Sequência alvo selecionada neste método.

2. Reação de RPA

  1. Projete e sintetize os pares de primers RPA para a sequência alvo. As sequências de pares de primers RPA são descritas na Tabela 2.
  2. Prepare o tampão de reação 5x RPA (Tabela 3) e MgCl2 (100 mM).
  3. Misture as quatro principais enzimas RPA (UvsX, UvsY, GP32, proteína Bsu) no tampão de reação 1x RPA, juntamente com os primers projetados com antecedência, conforme detalhado na Tabela 4.
  4. Vortex a mistura completamente.
  5. Adicione 1 μL do alvo obtido na etapa 1 para cada reação de RPA e misture bem por vórtice novamente.
  6. Adicione 7 μL de MgCl2 (100 mM) para iniciar a reação. O volume final de cada reação RPA é de 50 μL.
  7. Efectuar o ensaio a 37 °C durante 30 min.
  8. O produto RPA pode ser armazenado a 4 °C por alguns dias. À medida que os produtos RPA se degradam, use para detecção adicional o mais rápido possível para obter melhores resultados de diagnóstico.
  9. [Opcional] Realize eletroforese em gel de DNA.
    1. Retire 5 μL de produtos RPA, adicione um volume apropriado de tampão de carga de DNA 6x e conduza a eletroforese em gel de DNA no tampão EDTA de trisacetato (TAE).
    2. Execute a eletroforese abaixo de 120 V por cerca de 20 min até que as bandas do tampão de carga atinjam o fundo do gel.
    3. Determine se a sequência alvo foi amplificada com sucesso a partir da amostra, comparando o tamanho das bandas da amostra com as bandas do marcador.
NomeSeqüenciar
RPA primer FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA primer RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG

Tabela 2: Primers RPA usados neste método.

ComponenteConcentração originalAdição
PEG 20.000-114 mg
ATP100 mM125 μL
dNTPs25 mM48 μL
Tris-HCl1 milhão125 μL
TDT1 milhão125 μL
Fosfocreatina1 milhão250 μL
Creatina quinase10 μg/μL50 μL
ddH2O-277 μL
Total Volume-1 mL

Tabela 3: A composição do tampão de reação 5x RPA (pH 7,5).

ComponenteConcentração originalAdição
5x tampão de reação RPA-10 μL
Proteína UvsX5 mg/ml2,6 μL
Proteína UvsY5 mg/ml0,9 μL
Proteína GP325 mg/ml2,54 μL
Proteína Bsu5 mg/ml0,88 μL
primer para frente100 μM0,25 μL
primer invertido100 μM0,25 μL
ddH2O-24,58 μL
Alvo-1 μL
*MgCl2100 mM7 μL
Total Volume50 μL
*MgCl2 precisa ser adicionado por último para iniciar a reação de RPA.

Tabela 4: A composição da reação RPA.

3. Detecção de CRISPR/Cas12a sem SPM

  1. Use os crRNAs (Tabela de Materiais) da sequência alvo e a sonda repórter ssDNA ligando um fluoróforo e um supressor para CRISPR/Cas12a. Aqui, a carboxitetrametilrodamina (TAMRA) está ligada como o fluoróforo nas extremidades 5 'das sondas repórter ssDNA e o Black Hole Quencher-2 (BHQ2) como o supressor nas extremidades 3 '. A sequência detalhada do repórter crRNA e ssDNA é descrita na Tabela 5.
  2. Prepare a bactéria Lachnospiraceae Cas12a (LbCas12a)
  3. Dissolva 1 μL do produto da reação RPA da seção 2 em 1x tampão de reação CRISPR/Cas12a com complexos LbCas12a-crRNA e sonda repórter ssDNA de 500 nM em um volume de reação de 100 μL.
  4. Depois de misturar LbCas12a e crRNA, deixe a mistura descansar por pelo menos 5 min para formar um complexo funcional. Após a incubação, adicionar outros componentes à mistura de reação e realizar toda a reação a 37 °C. O volume final de cada reação CRISPR/Cas12a é de 100 μL. As concentrações detalhadas de cada componente em cada reação CRISPR/Cas12a estão descritas na Tabela 6.
  5. Execute a reação de detecção CRISPR/Cas12a de 100 μL a 37 °C por 30 min.
  6. Examinar constantemente os sinais de fluorescência por um leitor de microplacas com um comprimento de onda de excitação de 535 nm e um comprimento de onda de emissão de 595 nm com um ganho de 60.
    NOTA: A detecção de diferentes comprimentos de onda de excitação e emissão de luz depende da escolha do fluoróforo e do atenuador nas sondas repórter ssDNA projetadas anteriormente.
  7. Para esses dados coletados, divida o valor de controle pela medição das amostras positivas para normalizar todos os dados e, em seguida, integre-os para uma análise de teste t de duas amostras.
NomeSeqüenciar
LbCas12a crRNA para FV3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT
repórter ssDNA/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

Tabela 5: Sequências de crRNA CRISPR/Cas12a e repórter ssDNA usadas neste método.

ComponenteConcentração originalAdição
NEBuffer r2.1-10 μL
Lba Cas12a (Cpf1)10 μM0,5 μL
crRNA10 μM0,625 μL
Aguarde pelo menos 5 minutos para permitir que o complexo LbCas12a/crRNA se combine.
Repórter de DNA100 μM0,5 μL
ddH2O-87,375 μL
Alvo-1 μL
Total Volume-100 μL

Tabela 6: A composição da reação CRISPR/Cas12a.

4. Configuração do SPM

  1. Para o caminho de excitação, defina um feixe de laser para passar pelos filtros de densidade neutra (ND) para atenuar a intensidade do laser.
  2. Gerar um feixe colimado a partir de uma lente asférica (a seguir designada por L1) e refleti-lo através do espelho dicróico (DM).
  3. Direcione a luz para a lâmina de vidro onde a amostra é colocada através da objetiva (20x) para iluminar e excitar a fluorescência da amostra. A platina da amostra permite o ajuste preciso do plano focal, direcionando o feixe para o plano focal traseiro da objetiva. As etapas mencionadas acima formam o caminho de excitação do instrumento SPM.
  4. Para o caminho de emissão, posicione uma lente externa (doravante denominada L2) para formar uma imagem intermediária do outro lado da objetiva. A objetiva ilumina simultaneamente a amostra e coleta o sinal de emissão.
  5. Registre o sinal de fluorescência da amostra usando o smartphone colocado no final do caminho de emissão. Use um suporte estável para evitar tremores.
  6. Defina um filtro passa-banda entre L1 e a câmera do smartphone para filtrar a luz excitada, permitindo que apenas a luz emitida da amostra chegue à câmera, o que pode otimizar a detecção.
  7. Imobilize a configuração do SPM em uma placa de ensaio para implantação portátil.
    NOTA: O esquema e a aparência física do dispositivo SPM para detecção de fluorescência com base na reação RPA-CRISPR/Cas12a são mostrados na Figura 2. A detecção de CRISPR/Cas12a ocorre na lâmina de vidro pré-tratada descrita na próxima etapa.

figure-protocol-1
Figura 2: Aparência esquemática e física do dispositivo SPM usado para detecção de fluorescência. (A) A aparência física do dispositivo SPM para coleta de imagens de fluorescência após a reação RPA-CRISPR/Cas12a. (B) Esquema do dispositivo SPM para detecção de fluorescência com base na reação RPA-CRISPR/Cas12a. Essa figura é modificada (posição e cor da imagem ajustadas) com permissão de Lei et al.35. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Tratamento de lâmina de vidro para detecção com SPM

  1. Preparar o polidimetilsiloxano (PDMS) misturando a base e o agente de cura na proporção de 10:1, seguido de cozedura numa placa de aquecimento a 80 °C durante 2 h.
  2. Trate o PDMS e a lâmina de vidro (Comprimento: 75 mm; Altura: 50 mm) com tratamento de plasma de oxigênio por 120 s, depois pressione-os juntos.
  3. Asse o vidro/PDMS a 95 °C por 2 h; é selado permanentemente pela ligação Si-O-Si. O PDMS tem alta transparência e sem autofluorescência, o que é propício para a detecção de SPM. O tratamento da lâmina de vidro e da PMDS é realizado de acordo com He et al.32

6. Detecção CRISPR/Cas12a com SPM

  1. Use os crRNAs (Tabela de Materiais) da sequência alvo e a sonda repórter ssDNA ligando um fluoróforo e um supressor para CRISPR/Cas12a. Neste método, a carboxitetrametilrodamina (TAMRA) está ligada como o fluoróforo nas extremidades 5' das sondas repórter ssDNA e o Black Hole Quencher-2 (BHQ2) como o supressor nas extremidades 3'. A sequência detalhada do repórter crRNA e ssDNA é descrita na Tabela 5.
  2. Prepare a bactéria Lachnospiraceae Cas12a (LbCas12a)
  3. Dissolva 1 μL do produto da reação RPA da seção 2 em 1x tampão de reação CRISPR/Cas12a com complexos LbCas12a-crRNA e sonda repórter ssDNA de 500 nM em um volume de reação de 100 μL.
  4. Depois de misturar LbCas12a e crRNA, deixe a mistura descansar por pelo menos 5 min para formar um complexo funcional. Após a incubação, adicionar outros componentes à mistura de reação e completar a reação a 37 °C. O volume final de cada reação CRISPR/Cas12a é de 100 μL. As concentrações detalhadas de cada componente em cada reação CRISPR/Cas12a estão descritas na Tabela 6.
  5. Execute a reação de detecção CRISPR/Cas12a de 100 μL na lâmina de vidro pré-tratada e cubra-a com uma lamínula. Incubar a lâmina de vidro com reação em RT durante 10 min.
  6. Meça os sinais de fluorescência pelo SPM. Coloque a lâmina de vidro com a reação de detecção no palco do SPM, mantenha uma distância adequada, ajuste a distância focal e a clareza, procure o campo de visão da reação e foque-o para capturar uma imagem.
    NOTA: Uma curva padrão deve ser obtida primeiro para que os dados das amostras possam ser dimensionados para a faixa de concentração aproximada. Várias concentrações de alvos purificados são usadas, incluindo 10 nM, 1 nM, 100 pM e 10 pM, outro vírus como controle negativo (antes do RPA).

7. Aumento de dados e dados

  1. Colete as imagens de fluorescência do ensaio de detecção na seção 6 como conjuntos de dados. Repita pelo menos três detecções paralelas para cada exemplo para garantir o paralelismo de dados.
    1. Algumas maneiras apropriadas de obter maior paralelismo podem ser aprovadas. Por exemplo, ao coletar as imagens de fluorescência de cada amostra, foque manualmente e procure um campo relativamente mais claro para tirar imagens. Ao mesmo tempo, fotografe cada amostra para obter o sinal de fluorescência em mais de cinco locais diferentes.
  2. Meça o valor médio de cinza de cada imagem e o desvio padrão do valor médio de cinza em um grupo de concentração por ImageJ.
  3. Defina um intervalo de intensidades [mediana - desvio padrão, mediana + desvio padrão] para limpeza de dados.
    NOTA: Nas imagens obtidas nos primeiros passos, pode haver imagens com grandes diferenças, por isso é necessário rastrear as imagens. Se as intensidades das imagens estiverem fora do limite definido, elas devem ser consideradas discrepantes e excluídas.
  4. Rotule as imagens para o alvo purificado em concentrações crescentes com 0-6 em ordem crescente, respectivamente.
  5. Para aumentar a robustez do sistema e evitar o ajuste excessivo, implemente técnicas de aumento de imagem, como inversão horizontal, inversão vertical e ruído aleatório por meio de funções de transformação em Python. Isso ajuda a introduzir variações no conjunto de dados.

8. Transferir aprendizado

  1. Como rede de backbone, adote o modelo de aprendizado profundo AlexNet33 para classificação.
  2. Para atender à restrição do modelo pré-treinado na seção 7, remodele as imagens de entrada para 224 pixels x 224 pixels x 3 canais (altura e largura de 224 pixels e uma profundidade de 3 canais para os canais de cores vermelho, verde e azul) por meio de funções de transformação em Python.
    NOTA: Esta etapa é um pré-processamento comum para dados heterogêneos no aprendizado de transferência, incluindo transformação.
  3. Use uma rede de backbone pré-treinada com o conjunto de dados ImageNet para extrair recursos enquanto aproveita os pesos das camadas ocultas intermediárias que foram aprendidas.
  4. No contexto do trabalho de classificação de fluorescência, substitua a camada final totalmente conectada da rede neural, que originalmente incluía 1000 neurônios para a tarefa ImageNet, por uma camada totalmente conectada com 2 ou 7 neurônios.
  5. Avalie o desempenho do modelo de treinamento de configuração usando uma série de métricas, incluindo matriz de confusão, exatidão, precisão, recall e pontuação F1 com base em Lawton e Viriri34.

Resultados

Este método se concentra em um sistema de detecção rápido, fácil de implementar, altamente sensível e no local de atendimento (POC) para vírus de DNA. O design dos pares de primers para a reação RPA e o design do crRNA para a reação CRISPR/Cas12a são duas das partes essenciais, pois afetarão a eficiência da reação RPA-CRISPR/Cas12a e influenciarão a detecção e classificação subsequentes.

Neste método, o FV3 é considerado um exemplo de detecção de vírus de DNA. Alguns pares de primers RPA para FV3 são projetados, e o mais eficiente é escolhido e garantido que ele mostre boa eficiência de amplificação, o que pode ser confirmado garantindo o brilho e o tamanho das bandas por meio de eletroforese em gel dos produtos RPA, conforme mencionado na etapa 2.8. Ao mesmo tempo, projetamos crRNAs CRISPR/Cas12a e escolhemos o mais eficiente com base no sinal de fluorescência mais forte acionado na reação CRISPR/Cas12a sem RPA. A sequência dos três primers para frente e três para trás para RPA e três crRNA para Cas12a são mostrados na Tabela 7. Com base nos resultados da eletroforese em gel de agarose mostrados na Figura 3, o6º par de primers oferece melhor eficiência de amplificação (F2 e R1), que é selecionado para o método. Conforme mostrado na Figura 4, o crRNA-3 é o mais eficiente para a clivagem colateral, que é selecionada no método.

RPA primer F1ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAG
RPA primer F2ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA primer F3TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAGTGGT
RPA primer R1GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG
Primário RPA R2GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAA
RPA primer R3CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG
LbCas12a crRNA-1uaauucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA
LbCas12a crRNA-2uaauucuacuaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG
LbCas12a crRNA-3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT

Tabela 7: Os primers RPA e sequências de crRNA para otimização da reação.

figure-results-1
Figura 3: Resultados da eletroforese em gel de agarose para avaliação da eficiência do RPA. As reações de RPA foram realizadas usando diferentes combinações de primers sob a mesma condição com um alvo purificado de 1 nM. O número 1 foi considerado como a combinação de RPA-F3 e RPA-R3, 2 como RPA-F3 e RPA-R2, 3 como RPA-F3 e RPA-R1, 4 como RPA-F2 e RPA-R3, 5 como RPA-F2 e RPA-R2, 6 representados como RPA-F2 e RPA-R1, 7 como RPA-F1 e RPA-R3, 8 como RPA-F1 e RPA-R2, 9 como RPA-F1 e RPA-R2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 4: Detecção dos fragmentos alvo FV3 com três crRNAs diferentes pelo CRISPR/Cas12a. As concentrações de fragmentos purificados aplicados na detecção foram de 10 nM a 100 pM de DNA alvo versus 10 nM de DNA controle com 30 min de incubação. Essa figura é reutilizada com permissão de Lei et al.35. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para gerar os dados na Figura 5, aplicamos primers RPA otimizados, crRNA e a configuração SPM. Para ter uma noção melhor da concentração nas amostras, amplificamos fragmentos de DNA de 240 pb do gene do capsídeo principal altamente conservado (MCP) de FV3 e vírus infeccioso do baço e necrose renal (ISKNV, Iridoviridae) como alvo e controle por meio de um kit de amplificação de PCR, que é executado com os procedimentos mostrados na Tabela 8. O tamanho do DNA amplificado é confirmado por eletroforese em gel de agarose, e extraímos o alvo e o controle do dsDNA purificado do gel. Os fragmentos de DNA purificados são quantificados usando um espectrofotômetro NanoDrop 2000.

figure-results-3
Figura 5: As imagens de fluorescência do DNA alvo purificado e do DNA de controle. (A) O controle negativo. (B) DNA alvo purificado (100 pM). Essa figura é reutilizada com permissão de Lei et al.35. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

PalcoTemperatura (°C)HoraCiclo(s)
Partida a quente955 min1
Desnaturação9530 s35
Recozimento6045 s
Extensão7230 s
Extensão725 min1
Armazenamento4--

Tabela 8: O procedimento de amplificação da PCR.

Apenas para referência, um conjunto de dados incluindo 162 imagens de fluorescência é obtido após a limpeza dos dados. O número de imagens de fluorescência para análise posterior precisa ser expandido, e treinamos o conjunto de dados usando 337 imagens de fluorescência para classificação binária e 398 para classificação multiclasse.

Alcançamos a detecção em cerca de 40 minutos, incluindo 30 minutos para amplificação de RPA e 10 minutos para detecção de LbCas12a após RPA. Ao usar o sistema de detecção desenvolvido com primers RPA e crRNA selecionados, a intensidade do sinal de 10 aM FV3 e controle mostra diferenças significativas, conforme mostrado na Figura Suplementar 1.

Figura suplementar 1: As estatísticas da intensidade do sinal para imagens de fluorescência coletadas em reações RPA-LbCas12a com várias concentrações de fragmentos purificados. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001; : p < 0,0001; F: FV3, I: ISKNV; A.U.: Unidade de Absorbância. Essa figura é reutilizada com permissão de Lei et al.35. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Nesse método, desenvolvemos um sistema de detecção de vírus de DNA POC rápido, fácil de implementar, altamente sensível, específico de sequência e POC com assistência de IA. Após a obtenção das amostras, o RPA é aplicado para amplificar a sequência alvo e, em seguida, o CRISPR/Cas12a pode reconhecer o DNA alvo e liberar fluorescência, o que amplia o sinal de detecção. A microscopia portátil de smartphone é construída para obter imagens de fluorescência, e modelos de aprendizado profundo com aprendizado de transferência são usados para classificação binária das imagens de amostras positivas e negativas. O FV3 é tomado como amostra positiva neste método e, em seguida, investigado de várias perspectivas para melhorar a especificidade e a sensibilidade do sistema proposto.

A primeira estratégia é projetar primers específicos de RPA e selecionar os primers mais eficientes. A eficiência de amplificação da reação RPA é influenciada por diferentes primers36. A especificidade dos primers usados para amplificar o gene alvo das cepas de vírus de DNA pode ser confirmada por detonação contra o banco de dados padrão de sequenciamento de nucleotídeos. Como não há guia para projetar pares de primers RPA eficientes, a validação experimental é necessária37.

Outra abordagem é projetar o crRNA do vírus alvo para a reação CRISPR / Cas12a, uma vez que a eficiência da clivagem colateral contribui significativamente para a sensibilidade de detecção38,39. A força do sinal de fluorescência acionado na reação CRISPR/Cas12a sem RPA precisa ser considerada na seleção do melhor crRNA. Além disso, a atividade colateral da proteína LbCas12a é constantemente ativada por 24 h32, o que pode beneficiar a detecção.

Com o objetivo de identificar vírus e visualizar partículas virais, a microscopia de fluorescência tem sido aplicada 40,41. No entanto, a microscopia convencional é complicada e cara para um diagnóstico rápido de POC. Assim, no sistema proposto, um SPM portátil com menor custo é construído para atingir o sinal de fluorescência capturando as imagens para detecção de POC. Esse SPM portátil custa muito menos do que um leitor de placas comercializado ou uma máquina de PCR em tempo real, que é econômica para a configuração do sistema de detecção.

Esta plataforma proposta também precisa de ser melhorada em alguns aspectos. Ao aplicar esta plataforma de detecção à detecção de outros vírus de DNA, tanto o primer RPA quanto a sequência Cas12a-crRNA precisam ser redesenhados. Como não há guia para seu projeto, experimentos precisam ser realizados para avaliar sua eficiência. Embora o sistema proposto possa atender às vantagens da portabilidade, o tamanho de todo o sistema ainda precisa ser reduzido para obter um sistema mais leve. Como a câmera do celular em si não é fácil de focar para fotos de perto, leva tempo para se ajustar durante o processo de obtenção de imagens fluorescentes, incluindo o campo de visão, para imagens com melhor qualidade.

Com os avanços na tecnologia relacionada e suas novas aplicações, a eficiência na detecção de POC continuará a melhorar. O método apresentado aqui é um exemplo de melhoria que pode ajudar na detecção de POC com base no sistema CRISPR/Cas12a e na plataforma SPM, com nova assistência de IA. Além disso, o sistema integrado pode ser utilizado para identificar qualquer alvo de DNA devido à reprogramabilidade do crRNA. O sistema RPA-CRISPR/Cas12a-AI terá uma posição significativa na identificação de patógenos de DNA em termos de sensibilidade de detecção, especificidade, tempo e confiabilidade.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China 31970752, Ciência, Tecnologia e Comissão de Inovação do Município de Shenzhen JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Financiamento Aberto do Laboratório da Baía de Shenzhen, SZBL2020090501004; Fundação de Ciência de Pós-Doutorado da China 2020M680023; e Administração Geral das Alfândegas da República Popular da China 2021HK007.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
20x amplificaçãoOLYMPUSOPLN20X
laser verde de 532 nmThorlabsPL201com potência de saída de 0,9 mW
de onda de corte de 535 nmcromoAT535
6x buffer de carregamento de DNAThermo scientificR0611
Microplaca preta de 96 poçosCorning Incorporated3603Preto com fundo plano transparente
Lente asféricaLubangN / A
Filtro passa-bandaSEMROCKFF01-542 / 27-25
Bsu DNA PolimeraseATG BiotecnologiaM103Grande
Fragmento crRNASangon BiotechN / A
Fragmentos de DNASangon BiotechN / A
Suportes dicróicosRuicageN / A
Espelho dicróicoSEMROCKFF555-Di03-25x36com um comprimento de onda de corte de 535 nm
E.Z.N.A Kit de extração de gelOmega BiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T
Suportes de filtroRuicageN/A
Fluorophore-ssDNA-Quencher sondas repórterSangon BiotechN/ATAMRA (carboxitetrametilrodamina) como fluoróforo nas 5 extremidades; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) como o supressor nas 3 extremidades
GP32ATG BiotechnologyM104
ImageJVersão de código aberto1.53t 24Baixado de https://imagej.nih.gov/ij/ 
Leitor de microplacasSPARK, TECANN/A
Multi-Block thermal Cycler Instrumento de PCRLongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c EspectrofotômetrosThermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Beijing) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a Tampão de reação
Tratamento de plasma de oxigênio Eletro-Técnica  ProdutosN/A
Patógeno Inativar, Livre de extração de ácido nucleico, Tampão direto para PCR com Proteinase K (PINDBK)EbioPINDBK -25mL
Pares de primers PCRSangon BiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
RPA pares de primersSangon BiotechN/A
SmartphoneHuaweiMate10
Estágios de traduçãoRuicageN/A
Filtros de densidade neutra transmitidaThorlabsND40A
Lentes acromáticas triplasThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiotecnologiaM105
UvsYATG BiotecnologiaM106
comprimento

Referências

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