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Artigo de método

AMEBaS: Extração Automática da Linha Média e Subtração de Fundo de Time-Lapses de Fluorescência Ratiométrica de Células Individuais Polarizadas

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DOI:

10.3791/64857

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23 de junho de 2023

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1Institute of Mathematics and Statistics, University of São Paulo, 2Center for Mathematics, Computing and Cognition, Federal University of ABC, 3Department of Botany, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 4Cell Biology and Molecular Genetics Department, University of Maryland, 5Department of Biosciences, University of Milan, 6Department of Physics, Politecnico di Milano

Neste artigo

Resumo

Os métodos atuais para analisar a dinâmica intracelular de células isoladas polarizadas são frequentemente manuais e carecem de padronização. Este manuscrito introduz um novo pipeline de análise de imagens para automatizar a extração da linha média de células polarizadas simples e quantificar o comportamento espaço-temporal de lapsos de tempo em uma interface on-line amigável.

Resumo

A polaridade celular é um fenômeno macroscópico estabelecido por um conjunto de moléculas e estruturas espacialmente concentradas que culminam no surgimento de domínios especializados no nível subcelular. Está associada ao desenvolvimento de estruturas morfológicas assimétricas subjacentes a funções-chave biológicas, tais como divisão celular, crescimento e migração. Além disso, a ruptura da polaridade celular tem sido associada a distúrbios relacionados ao tecido, como câncer e displasia gástrica.

Os métodos atuais para avaliar a dinâmica espaço-temporal de repórteres fluorescentes em células polarizadas individuais geralmente envolvem etapas manuais para traçar uma linha média ao longo do eixo principal das células, o que é demorado e propenso a fortes vieses. Além disso, embora a análise ratiométrica possa corrigir a distribuição desigual das moléculas repórteres usando dois canais de fluorescência, as técnicas de subtração de fundo são frequentemente arbitrárias e carecem de suporte estatístico.

Este manuscrito apresenta um novo pipeline computacional para automatizar e quantificar o comportamento espaço-temporal de células individuais usando um modelo de polaridade celular: crescimento de pelos do tubo polínico/raiz e dinâmica de íons citosólicos. Um algoritmo de três etapas foi desenvolvido para processar imagens ratiométricas e extrair uma representação quantitativa da dinâmica e crescimento intracelular. A primeira etapa segmenta a célula do plano de fundo, produzindo uma máscara binária por meio de uma técnica de limiar no espaço de intensidade de pixel. O segundo passo traça um caminho através da linha média da célula através de uma operação de esqueletização. Finalmente, a terceira etapa fornece os dados processados como um timelapse ratiométrico e produz um quimógrafo ratiométrico (ou seja, um perfil espacial 1D ao longo do tempo). Dados de imagens ratiométricas adquiridas com repórteres fluorescentes codificados geneticamente de tubos polínicos em crescimento foram usados para avaliar o método. Esse pipeline permite uma representação mais rápida, menos enviesada e mais precisa da dinâmica espaço-temporal ao longo da linha média de células polarizadas, avançando assim o kit de ferramentas quantitativas disponível para investigar a polaridade celular. O código-fonte do AMEBaS Python está disponível em: https://github.com/badain/amebas.git

Introdução

A polaridade celular é um processo biológico fundamental no qual a ação concertada de um conjunto de moléculas e estruturas espacialmente concentradas culmina no estabelecimento de domínios morfológicos subcelularesespecializados1. A divisão celular, o crescimento e a migração dependem desses sítios de polaridade, enquanto sua perda tem sido associada ao câncer em desordens relacionadas ao tecidoepitelial2.

Células em crescimento apical são um exemplo dramático de polaridade, onde o local de polaridade na ponta tipicamente se reorienta para pistas extracelulares3. Estes incluem neuritos em desenvolvimento, hifas fúngicas, pelos radiculares e tubos polínicos, onde múltiplos processos celulares mostram diferenças pronunciadas da ponta da célula em direção à haste. Em tubos polínicos, em particular, a polimerização de actina, o tráfego de vesículas e as concentrações iônicas são marcadamente polarizados, mostrando gradientes focados na ponta4. Os tubos polínicos são os gametófitos masculinos das plantas com flores e são responsáveis por entregar os espermatozoides ao óvulo, crescendo exclusivamente no ápice da célula a uma das taxas de crescimento mais rápidas conhecidas para uma única célula. Os gradientes focados na ponta de íons como cálcio 5 (Ca2+) e prótons 6 (H+) desempenham um papel importante na sustentação do crescimento do tubo polínico, o que é essencial para cumprir sua principal função biológica que culmina em uma dupla fertilização 5,6. Assim, métodos quantitativos para analisar a dinâmica espaço-temporal ao longo da linha média de células em crescimento apical são essenciais para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao crescimento polarizado7,8,9. Os pesquisadores geralmente usam quimógrafos, ou seja, uma matriz que representa as intensidades de pixel da linha média da célula (por exemplo, colunas) ao longo do tempo (por exemplo, linhas), o que permite visualizar o crescimento e a migração da célula na diagonal (Figura 1). Apesar de sua utilidade, os quimógrafos são frequentemente extraídos traçando manualmente a linha média, sendo propensos a vieses e erros humanos, além de serem bastante trabalhosos. Isso requer um método automatizado de extração de linha média que é a primeira característica do pipeline introduzido aqui chamado AMEBaS: Automatic Midline Extraction e Background Subtração de lapsos de tempo de fluorescência ratiométrica de células individuais polarizadas.

Em termos de procedimentos experimentais, imagens quantitativas de íons/moléculas/espécies de interesse em células isoladas podem ser obtidas com sondas fluorescentes codificadasgeneticamente10. Dentre as escolhas em constante expansão, as sondas ratiométricas são uma das mais precisas, pois emitem diferentes comprimentos de onda de fluorescência quando ligadas/desligadas às moléculas de interesse11. Isso permite corrigir a heterogeneidade espacial na concentração intracelular da sonda usando a razão de dois canais com seu fundo específico do canal subtraído. No entanto, estimar o limiar de fundo para cada canal e ponto de tempo pode ser uma tarefa complexa, pois muitas vezes varia no espaço devido a efeitos como sombreamento, onde os cantos da imagem têm variação de luminosidade em relação ao centro, e no tempo devido ao desbotamento do fluoróforo (fotoclareamento)12. Embora existam vários métodos possíveis, este artigo propõe determinar a intensidade de fundo automaticamente usando o limiar de segmentação obtido com o algoritmo Isodata13, que é então suavizado através de quadros através de regressão polinomial como padrão. Componentes espaciais decorrentes da heterogeneidade da fluorescência não relacionados à célula-alvo removida em12, no entanto, foram ignorados por este método. O limiar automático pode ser realizado por vários métodos, mas o algoritmo Isodata produziu os melhores resultados empiricamente. Assim, a subtração automática do valor de fundo e o cálculo ratiométrico são a segunda característica principal do AMEBaS (Figura 1), que, em conjunto, recebe como entrada uma pilha de imagens de microscopia de fluorescência de canal duplo, estima a linha média da célula e o fundo específico do canal, e produz quimógrafos de ambos os canais e sua razão (saída principal #1) após subtração, suavização e remoção de outlier, juntamente com uma pilha de imagens ratiometric (saída principal #2).

O AMEBaS foi testado com lapsos de tempo de fluorescência de tubos polínicos de Arabidopsis em crescimento obtidos ao microscópio, com sensores de razão de Ca2+ (CaMeleon)8 ou pH (pHluorin)6 expressos sob o promotor LAT52 pólen-específico. As imagens de cada canal foram obtidas a cada 4 s acopladas a um microscópio invertido, uma câmera frontal iluminada (2560 pixels × 2160 pixels, tamanho do pixel 6,45 μm), um iluminador de fluorescência e uma lente objetiva de imersão em água 63x, 1.2NA. As configurações dos filtros utilizados para o CaMeleon foram: excitação 426-450 nm (CFP) e 505-515 nm (YFP), emissão 458-487 nm (CFP) e 520-550 nm (YFP), enquanto para pHluorin, excitação 318-390 nm (DAPI) e 428-475 nm (FITC), emissão 435-448 nm (DAPI) e 523-536 nm (FITC). Um conjunto completo de dados foi adicionado para teste em Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.

Além disso, o duto foi testado com dados de pelos radiculares, onde as imagens foram realizadas com um microscópio de folha de luz (SPIM), como descrito anteriormente 15,16 com pelos radiculares de Arabidopsis expressando o repórter NES-YC3.6 codificado geneticamente Ca2+ sob o controle do promotor UBQ1017. O software LabView caseiro que controlava a aquisição da câmera, a tradução da amostra e o obturador do microscópio de folha de luz permitiu a observação dos dois canais cpVenus e CFP, mas também a visualização de sua proporção em tempo real. Cada imagem de razão do time-lapse representou uma projeção de intensidade máxima (MIP) entre as imagens dos canais fluorescentes cpVenus e CFP obtidas a partir de 15 cortes da amostra espaçados de 3 μm entre si. A razão de lapso de tempo cpVenus/CFP das MIPs foi salva e usada diretamente para a análise AMEBaS.

Embora esse pipeline possa trabalhar com vários tipos de células em crescimento e migração, ele foi projetado especificamente para analisar células em crescimento que crescem exclusivamente na ponta, como tubos polínicos, pelos radiculares e hifas fúngicas, onde há uma correspondência das regiões citoplasmáticas não crescentes entre os quadros. Quando tal correspondência não estiver presente, o usuário deve escolher a opção complete_skeletonization na etapa 1.3.1.1 (consulte a seção Discussão para obter mais detalhes).

figure-introduction-1
Figura 1: Uma visão geral do fluxo de trabalho do pipeline. O pipeline AMEBaS analisa e processa lapsos de tempo microscópicos em três etapas principais: Segmentação de célula única, Rastreamento de linha média e Geração de quimógrafo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

1. Protocolo de notebook interativo

O notebook Jupyter pode ser usado diretamente na web usando o Google Colab no https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, onde as instruções abaixo foram baseadas. Como alternativa, o notebook Jupyter está disponível no https://github.com/badain/amebas, onde pode ser baixado e configurado para ser executado localmente no Jupyter (o Anaconda pode fornecer um processo de instalação fácil e multiplataforma). Um teste completo pode ser encontrado em Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), contendo dados de canal único e duplo de tubos polínicos de Arabidopsis expressando pH ou Ca2+ repórteres 14. O pipeline foi dividido em partes, onde cada etapa pode ser executada clicando no botão play depois de definir as opções específicas do usuário. Os arquivos necessários para este estudo estão disponíveis na pasta zip principal AMEBaS- (Supplementary Coding File 1).

  1. Abra o bloco de anotações Jupyter e leia os arquivos de lapso de tempo.
    1. Navegue até a página inicial do bloco de anotações interativo no Google Colab mencionado acima ou faça o download e abra o bloco de anotações AMEBaS_Local.ipynb do GitHub.
    2. Prepare a configuração do diretório para os dados de entrada e saída:
      1. Se estiver usando a versão local, coloque o time-lapse de fluorescência como um arquivo TIFF ou DV dentro de uma pasta chamada dados que devem estar na pasta raiz do programa. Uma pasta nomeada deve ser criada para receber os dados gerados. Em seguida, execute o bloco de código de instalação.
      2. Se estiver usando o bloco de anotações no Google Colab, execute o bloco de código Configuração para gerar automaticamente os dados e as pastas de saída .
    3. Execute o bloco de código de entrada de arquivo para ler os dados de lapso de tempo clicando no botão de reprodução . Se estiver usando a versão Google Colab do notebook, clique no botão Escolher arquivo para fazer o upload direto do arquivo de lapso de tempo para a pasta de dados .
      NOTA: O número de canais será detectado automaticamente com base na dimensão da imagem.
    4. Escolha se saídas adicionais de cada etapa serão geradas definindo o parâmetro 'verbose' como True ou False.
  2. Detecte a célula principal e o segmento a partir do plano de fundo (Figura 2).
    1. Execute o bloco de código Segmentação de célula única para separar automaticamente a célula de interesse do plano de fundo clicando no botão de reprodução .
      NOTA: Os filtros mediano e gaussiano serão aplicados como uma etapa de pré-processamento para remover ruídos indesejados antes de segmentar o primeiro plano do plano de fundo por meio do limiar de Isodata e isolar a região da maior área para remover artefatos indesejados.
      1. Ajuste o valor sigma usado pelo Gaussiano na variável 'sigma' para ajustar a suavidade da máscara de segmentação. O valor padrão é 2.0.
      2. Defina a estimativa de variável como False para armazenar o limite estimado de Isodata diretamente ou como True para suavizá-lo em quadros vizinhos usando regressão polinomial local (LOESS). Ajuste sua função alterando a variável n_points . O valor padrão é 40.
  3. Traçar linha média ao longo da extensão celular (Figura 3).
    1. Execute o bloco de código Cell Midline Tracing clicando no botão play para esqueletizar automaticamente a célula usando o método18 de Lee e estender a ponta do último esqueleto por extrapolação linear.
      1. Escolha traçar a linha média apenas no último quadro ou uma vez por quadro, ajustando o argumento complete_skeletonization .
        Observação : quando todos os quadros são esqueletizados, extrapolação é ignorada.
      2. Defina a fração de pontos no esqueleto a ser interpolado durante a extrapolação ajustando a variável interpolation_fraction . O valor padrão é 0,25.
      3. Escolha o comprimento da extrapolação da linha média alterando a variável extrapolation_length. O padrão é -1, que estende o esqueleto até a borda mais próxima.
  4. Gere quimógrafos para cada canal ( Figura 4).
    1. Execute o primeiro bloco de código de Visualização de Dados clicando no botão de reprodução para gerar quimógrafos automaticamente para ambos os canais.
      1. Escolha o tamanho do kernel gaussiano usado para suavização ajustando a variável kymograph_kernel.
        Observação : corresponde ao tamanho da vizinhança (em pixels) sobre o qual as intensidades de pixel são médias. O padrão é 3 pixels x 3 pixels.
      2. Esqueletos não estendidos geram Kymographs tampados que devem usar um mapa de cores personalizado para exibir adequadamente suas intensidades. Escolha a porcentagem de fração das intensidades que serão atribuídas à cor de fundo, preto, ajustando a variável shift_fraction . O valor padrão é 0,7.
  5. Calcule a razão entre canais (Figura 5).
    1. Execute o segundo bloco de código de Visualização de Dados clicando no botão de reprodução para gerar automaticamente um quimógrafo ratiométrico e um timelapse ratiométrico (Figura 6).
      Observação : esta etapa só está disponível ao usar intervalos de tempo de canal duplo. O limiar de intensidade de fundo armazenado na etapa 1.2.1.2 é subtraído de cada canal.
      1. Ajuste a variável switch_ratio para alternar a ordem dos canais usados como numerador e denominador durante os cálculos de razão. O padrão é False.
      2. Escolha se o timelapse de proporção deve ser suavizado com uma passagem de filtro mediana ajustando a variável smooth_ratio . O padrão é False.
      3. Escolha se deseja remover outliers produzidos pelo sinal baixo do canal denominador manipulando a variável reject_outliers . O padrão é True e define outliers como valores 1,5 vezes o intervalo interquartil acima do terceiro quartil (onde estão 75% dos valores).
      4. Escolha se o plano de fundo na saída ratiometric deve ser exportado ajustando a variável background_ratio. O padrão é False, que o substitui por zeros.

figure-protocol-1
Figura 2: Etapa de segmentação de célula única. Técnicas de processamento de imagens, como filtragem, limiarização e marcação de área, são usadas para isolar o sinal de interesse (passo 1.2). Esses dados em particular apresentaram os seguintes valores para Menor Intensidade: 2556, Mediana: 3441 e Maior Intensidade: 32125. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-2
Figura 3: Visão geral do traçado da linha média- A linha média da célula única é obtida calculando-se seu esqueleto (branco). A ponta (magenta) é extrapolada linearmente dos últimos pontos no final do esqueleto (passo 1.3). Nessa composição, tanto a linha média quanto sua ponta são sobrepostas sobre a célula original. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-3
Figura 4: Quimógrafos do Timelapse - Comparação dos quimógrafos para cada canal gerado com o 'complete_skeletonization' desligado (passo 1.4). O eixo vertical descreve a progressão do tempo, e o eixo horizontal plota a intensidade média do caminho extrapolado da linha média seguido por uma única célula. Para esses dados específicos, o mapa colorido representa os seguintes valores para Canal 1 Menor intensidade: 2886, Mediana: 3167, Maior intensidade: 21021. Canal 2 Menor intensidade: 3030, Mediana: 3400, Maior intensidade: 29688. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-4
Figura 5: Suavização do limiar de fundo- O limiar de segmentação de fundo é estimado através do algoritmo isodata e, em seguida, suavizado através da regressão polinomial local (passo 1.5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-5
Figura 6: Resultados ratiométricos - (A) Comparação entre o último quadro do timelapse ratiométrico e o primeiro canal original segmentado. (B) Quimógrafo gerado a partir do timelapse ratiométrico (passo 1.5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Protocolo de modo de lote

  1. Baixe e coloque o arquivo pipeline.py do repositório GitHub do AMEBaS no mesmo diretório que os dados.
  2. Digite o local do arquivo na linha de comando após o arquivo de programa.
  3. Inclua - -v como um argumento posicional para mostrar as etapas internas do pipeline, se desejado.
  4. Inclua --s para escolher no valor sigma usado na etapa de pré-processamento do Filtro Gaussiano em preparação para segmentação celular. O padrão é 2.
  5. Inclua - - a para traçar a linha média para cada quadro do lapso de tempo. Por padrão, o pipeline usa apenas o último quadro.
  6. Incluir - -f para escolher a fração [0,1] do esqueleto a ser utilizada na interpolação. O valor padrão é 0,25.
  7. Inclua -e para escolher o comprimento em pixels do esqueleto extrapolado. O padrão é -1, que estende o esqueleto até a borda mais próxima.
  8. Inclua - -sf para escolher a fração do intervalo de cores que será deslocada para o plano de fundo em quimógrafos não extrapolados. O valor padrão é 0,7.
  9. Inclua - -k para determinar o tamanho do kernel usado na filtragem gaussiana do quimógrafo. O padrão é 3.
  10. Inclua - -eb para estimar a intensidade do limiar de fundo global por meio da regressão polinomial LOESS das intensidades de limite de fundo específicas do quadro.
    1. Personalize o número de pontos usados na suavização LOESS dos valores de limite de plano de fundo modificando o parâmetro - -n. O valor padrão é 40.
  11. Alterne os canais usados como numerador e denominador durante os cálculos de razão, incluindo - r ou - -switch_ratio, se o timelapse tiver dois canais. Por padrão, o segundo canal é o numerador e o primeiro é o denominador.
  12. Escolha se o timelapse de proporção deve ser suavizado com uma passagem de filtro mediano com o argumento - -sm . O padrão é False.
  13. Inclua -o para rejeitar pixels com intensidades anormais durante a geração de lapso de tempo ratiométrico.
  14. Escolha se o plano de fundo na saída ratiometric deve ser exportado usando o argumento - -b. O padrão é False, que o substitui por zeros.
  15. Pressione Enter para executar. A saída será gerada no mesmo diretório que o arquivo de programa.

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Resultados

O pipeline AMEBaS automatiza a extração da dinâmica da linha média de células individuais polarizadas de pilhas de imagens de microscopia de fluorescência, tornando-o menos demorado e menos propenso a erros humanos. O método quantifica esses lapsos de tempo gerando quimógrafos e pilhas de imagens ratiométricas (Figura 1) em células individuais em crescimento. Ele pode ser ajustado para trabalhar na migração de células únicas, mas mais experimentos são necessários. O AMEBaS é implementado em ...

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Discussão

O novo método apresentado aqui é uma ferramenta potente para agilizar e automatizar a análise de pilhas de imagens de microscopia de fluorescência de células polarizadas. Os métodos atuais descritos na literatura, como os plugins do ImageJ Kymograph, requerem o rastreamento manual da linha média da célula polarizada de interesse, uma tarefa que não é apenas demorada, mas também propensa a erros humanos. Como a definição da linha média nessa tubulação é sustentada por um método numérico18,19 que realiza a esqueletização, ...

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Divulgações

Os autores deste manuscrito declaram não haver interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos auxílios FAPESP 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 grant GM131043 e NSF grants MCB1714993, MCB1930165 pelo apoio financeiro. Os dados de pelos radiculares foram produzidos com a infraestrutura e sob a supervisão da Profª Andrea Bassi e do Prof. Alex Costa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GithubGithubhttps://github.com/badain/amebas
Google ColabGooglehttps://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb

Referências

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