AMEBaS: Extração Automática da Linha Média e Subtração de Fundo de Time-Lapses de Fluorescência Ratiométrica de Células Individuais Polarizadas

Resumo

Os métodos atuais para analisar a dinâmica intracelular de células isoladas polarizadas são frequentemente manuais e carecem de padronização. Este manuscrito introduz um novo pipeline de análise de imagens para automatizar a extração da linha média de células polarizadas simples e quantificar o comportamento espaço-temporal de lapsos de tempo em uma interface on-line amigável.

Resumo

A polaridade celular é um fenômeno macroscópico estabelecido por um conjunto de moléculas e estruturas espacialmente concentradas que culminam no surgimento de domínios especializados no nível subcelular. Está associada ao desenvolvimento de estruturas morfológicas assimétricas subjacentes a funções-chave biológicas, tais como divisão celular, crescimento e migração. Além disso, a ruptura da polaridade celular tem sido associada a distúrbios relacionados ao tecido, como câncer e displasia gástrica.

Os métodos atuais para avaliar a dinâmica espaço-temporal de repórteres fluorescentes em células polarizadas individuais geralmente envolvem etapas manuais para traçar uma linha média ao longo do eixo principal das células, o que é demorado e propenso a fortes vieses. Além disso, embora a análise ratiométrica possa corrigir a distribuição desigual das moléculas repórteres usando dois canais de fluorescência, as técnicas de subtração de fundo são frequentemente arbitrárias e carecem de suporte estatístico.

Este manuscrito apresenta um novo pipeline computacional para automatizar e quantificar o comportamento espaço-temporal de células individuais usando um modelo de polaridade celular: crescimento de pelos do tubo polínico/raiz e dinâmica de íons citosólicos. Um algoritmo de três etapas foi desenvolvido para processar imagens ratiométricas e extrair uma representação quantitativa da dinâmica e crescimento intracelular. A primeira etapa segmenta a célula do plano de fundo, produzindo uma máscara binária por meio de uma técnica de limiar no espaço de intensidade de pixel. O segundo passo traça um caminho através da linha média da célula através de uma operação de esqueletização. Finalmente, a terceira etapa fornece os dados processados como um timelapse ratiométrico e produz um quimógrafo ratiométrico (ou seja, um perfil espacial 1D ao longo do tempo). Dados de imagens ratiométricas adquiridas com repórteres fluorescentes codificados geneticamente de tubos polínicos em crescimento foram usados para avaliar o método. Esse pipeline permite uma representação mais rápida, menos enviesada e mais precisa da dinâmica espaço-temporal ao longo da linha média de células polarizadas, avançando assim o kit de ferramentas quantitativas disponível para investigar a polaridade celular. O código-fonte do AMEBaS Python está disponível em: https://github.com/badain/amebas.git

Introdução

A polaridade celular é um processo biológico fundamental no qual a ação concertada de um conjunto de moléculas e estruturas espacialmente concentradas culmina no estabelecimento de domínios morfológicos subcelulares^{especializados1}. A divisão celular, o crescimento e a migração dependem desses sítios de polaridade, enquanto sua perda tem sido associada ao câncer em desordens relacionadas ao tecido^epitelial2.

Células em crescimento apical são um exemplo dramático de polaridade, onde o local de polaridade na ponta tipicamente se reorienta para pistas extracelulares³. Estes....

Protocolo

1. Protocolo de notebook interativo

O notebook Jupyter pode ser usado diretamente na web usando o Google Colab no https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, onde as instruções abaixo foram baseadas. Como alternativa, o notebook Jupyter está disponível no https://github.com/badain/amebas, onde pode ser baixado e configurado para ser executado localmente no Jupyter (o Anaconda pode fornecer um processo de instalação fácil e multiplataforma). Um teste completo pode ser encontrado em Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), contendo dados de canal único e duplo de tubos polínicos ....

Resultados

O pipeline AMEBaS automatiza a extração da dinâmica da linha média de células individuais polarizadas de pilhas de imagens de microscopia de fluorescência, tornando-o menos demorado e menos propenso a erros humanos. O método quantifica esses lapsos de tempo gerando quimógrafos e pilhas de imagens ratiométricas (Figura 1) em células individuais em crescimento. Ele pode ser ajustado para trabalhar na migração de células únicas, mas mais experimentos são necessários. O AMEBaS é implementado em .......

Discussão

O novo método apresentado aqui é uma ferramenta potente para agilizar e automatizar a análise de pilhas de imagens de microscopia de fluorescência de células polarizadas. Os métodos atuais descritos na literatura, como os plugins do ImageJ Kymograph, requerem o rastreamento manual da linha média da célula polarizada de interesse, uma tarefa que não é apenas demorada, mas também propensa a erros humanos. Como a definição da linha média nessa tubulação é sustentada por um método numérico18,19 que realiza a esqueletização, .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Github	Github		https://github.com/badain/amebas
Google Colab	Google		https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb