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Artigo de método

Método de Cultura 3D de Esferoides de Linhagens Celulares de Zebrafish Embrionárias e Hepáticas

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DOI:

10.3791/64859

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20 de janeiro de 2023

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1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Cell Biology, Federal University of Paraná (UFPR), 4Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides de duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal).

Resumo

Linhagens celulares de peixes são modelos in vitro promissores para avaliação de ecotoxicidade; no entanto, os sistemas convencionais de cultura monocamada (cultura 2D) têm limitações bem conhecidas (por exemplo, longevidade da cultura e manutenção de algumas funções celulares in vivo ). Assim, culturas 3D, como os esferoides, têm sido propostas, uma vez que esses modelos podem reproduzir estruturas semelhantes a tecidos, recapturando melhor as condições in vivo . Este artigo descreve um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides com duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal). O protocolo consiste em plaquear as células em uma placa de fundo redondo, ultrabaixa e de 96 poços. Após 5 dias sob agitação orbital (70 rpm), um único esferoide por poço é formado. Os esferoides formados apresentam tamanho e forma estáveis, e este método evita a formação de múltiplos esferoides em um poço; assim, não é necessário escolher esferoides de tamanhos semelhantes. A facilidade, velocidade e reprodutibilidade deste método esferoide o tornam útil para testes in vitro de alto rendimento.

Introdução

Esferoides são pequenas esferas de células formadas quando as células são cultivadas em contato próximo célula a célula em cultura 3D. A capacidade dos esferoides de mimetizar o ambiente tecidual in vivo já foi estudada em uma variedade de linhagens celulares e célulasprimárias1,2. No entanto, embora os esferoides estejam bem desenvolvidos para estudos de toxicidade em mamíferos, o desenvolvimento de esferoides para estudos de toxicidade com vertebrados não mamíferos (por exemplo, peixes) ainda está em andamento3. Para linhagens celulares de peixes, esferoides têm sido desenvolvidos por uma variedade de métodos diferentes, como o orbital shaking (OS) usando diferentes tipos de placas de poço3,4,5,6,7, e o método de levitação magnética usando nanopartículas magnéticas8. No entanto, alguns desses métodos de cultivo para esferoides podem ter mais desvantagens do que outros.

Por exemplo, métodos giratórios em microplacas grandes (placas de 24 poços) podem gerar um alto número de esferoides diferindo em tamanho e forma; De fato, a formação de estruturas multiesferóides tem sido demonstrada7. Isso requer esforços intensos para escolher esferoides com tamanho e forma semelhantes para um experimento. O método de cultura 3D em gota suspensa é comumente utilizado para geração de esferoides de linhagens celulares de mamíferos 1,2,9,10,11, onde esferoides únicos por gota podem ser gerados, evitando os problemas descritos acima. No entanto, embora um método de queda suspensa modificado (queda suspensa + agitação orbital) seja capaz de gerar esferoides ZFL usando um método barato, ele tem suas desvantagens12. Os agregados celulares formados não podem ser mantidos por longos períodos nas gotas; assim, eles precisam ser transferidos para placas de poço. Esse processo requer manuseio intenso e longos períodos de trabalho em capela de fluxo laminar, pois é realizado em gota a gota com o uso de uma micropipeta12. Além disso, esse método requer 10 dias para formar completamente os esferoides ZFL (5 dias em gota suspensa + 5 dias em EO)12. Essas desvantagens podem limitar a aplicação de esferoides de peixes 3D para testes de toxicidade, especialmente considerando potenciais aplicações para priorização química e sustentabilidade do produto.

Assim, este artigo descreve um protocolo de cultura 3D capaz de gerar esferoides únicos de linhagens celulares ZFL (D. rerio hepatócito normal) e ZEM2S (embrião fase blastula de D. rerio) baseado no uso combinado de placas de fixação ultrabaixas de 96 poços (placas ULA) e um agitador orbital (22 mm de diâmetro rotacional). O método aplicado é simples e reprodutível, podendo gerar um grande número de esferoides de tamanho e forma semelhantes em um curto período (5 dias). As vantagens deste método podem apoiar a aplicação de modelos 3D de peixes para estudos de toxicidade aquática na indústria e no meio acadêmico, bem como o progresso da implementação de métodos alternativos para testes de ecotoxicidade.

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Protocolo

Os principais passos para gerar esferoides 3D de linhas celulares ZFL e ZEM2S em uma placa de fundo redondo de 96 poços são apresentados na Figura 1.

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais usados neste protocolo e a Tabela 1 para soluções e meios de cultura usados neste protocolo.

1. Meio de cultura celular e culturas de monocamada

  1. Cultivar ambas as linhagens celulares (ZFL, ZEM2S) como monocamadas em uma incubadora a 28 °C sem CO2, e subcultá-las em uma proporção de subcultivo de 1:3 quando atingirem ~80% de confluência.
    1. Comece com um frasco T75 de células de peixe-zebra a ~80% de confluência, cultivado como descrito acima.
    2. Retirar o meio completo e lavar as células adicionando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) (0,01 M) ao frasco de cultura com o auxílio de uma pipeta.
    3. Com o auxílio de uma pipeta, adicionar 3 mL de EDTA 1x tripsina-0,5 mM (0,05% [v/v]) aos frascos de cultura e incubar a 28 °C por 3 min para o desprendimento das células do frasco.
    4. Tocar suavemente no balão para libertar as células e, em seguida, interromper a digestão de tripsina adicionando 3 ml de meio de cultura completo ao balão.
    5. Com uma pipeta, transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL e centrifugar a 100 × g por 5 min.
    6. Após a formação do pellet, remova cuidadosamente o sobrenadante, adicione 1 mL do meio completo para a respectiva linhagem celular em uso (ZFL ou ZEM2S) e ressuspenda usando uma micropipeta. Pegue uma alíquota para contagem de células.

2. Contagem celular com teste de exclusão do corante azul de tripano

  1. Adicionar 10 μL da suspensão celular e 10 μL do corante azul de tripano a um microtubo para contar as células e avaliar sua viabilidade. Misture a suspensão celular e o corante usando uma pipeta.
  2. Em seguida, transferir 10 μL dessa mistura (suspensão celular + azul de tripano) para uma câmara de Neubauer e contar as células nos quatro grandes quadrados (quadrantes: Q) colocados nos cantos da câmara, considerando viáveis as células que não absorvem o azul de tripano. Calcule o número de células viáveis usando a equação (1):
    figure-protocol-1(1º)
  3. Para calcular o número final de células na suspensão celular, multiplique o número de células determinado pela equação (1) por 2 (o fator de diluição devido ao uso do azul de tripano).
    NOTA: Alternativamente, um sistema automatizado de contagem de células pode ser usado.

3. Revestimento celular em placas ULA

  1. Depois de calcular o número de células, ajuste a suspensão celular para a placa de 200 μL dessa suspensão por poço de uma placa ULA de fundo redondo de 96 poços com o número de células necessárias para cada linha celular, conforme indicado abaixo:
    1. Placa 7.000 células ZFL viáveis/poço; assim, para toda a placa ULA, utilizar 700.000 células em 20 mL de meio completo.
    2. Placa 3.500 células ZEM2S viáveis/poço; assim, para toda a placa ULA, utilizar 350.000 células em 20 mL de meio completo.
  2. Prepare a suspensão celular com a concentração ajustada de células em um reservatório médio e misture-a usando uma micropipeta multicanal, tomando cuidado para não formar espuma ou bolhas. Usando a micropipeta multicanal, adicionar 200 μL da suspensão celular ajustada a cada poço da placa ULA.
    NOTA: A placa deve ser selada com parafilme ou folha de vedação adesiva para evitar a evaporação do meio de cultura da placa de 96 poços.

4. Formação esferoide

  1. Incubar a placa ULA em um agitador orbital a 70 rpm por 5 dias em uma incubadora de 28 °C. Permitir que os esferoides se formem ao longo de 5 dias de agitação orbital (Figura 2), atingindo um tamanho médio de ~225 μm de diâmetro (esferoides ZFL) e ~226 μm de diâmetro (esferoides ZEM2S)12.
    NOTA: Após 5 dias de incubação (circularidade máxima), os esferoides estão prontos para uso.
  2. Para manter os esferoides em cultura por mais de 5 dias, remova 100 μL do meio gasto a cada 5 dias e adicione 100 μL de meio de cultura completo fresco usando uma micropipeta multicanal.
    NOTA: Tome cuidado para não aspirar os esferoides durante este processo.

5. Medição do tamanho (diâmetro) e forma (índice de circularidade) dos esferoides

  1. Adquira as imagens.
    1. Sob um microscópio de luz invertida com um sistema de captura de imagens, obtenha-se uma imagem de uma escala definida.
      NOTA: Use uma lâmina de calibração de estágio de microscópio ou uma lâmina de Neubauer (na qual os tamanhos dos quadrantes são conhecidos) para obter a escala.
    2. Sob o microscópio e usando a mesma lente objetiva usada para obter a imagem da escala, obtenha imagens dos esferoides totalmente formados (ou seja, esferoides de 5 dias de idade).
      NOTA: Todas as imagens devem ser tiradas usando o mesmo sistema de captura de imagem, pois a resolução da imagem é importante para determinar o tamanho e a forma dos esferoides, e pode diferir entre os tipos de sistemas.
  2. Defina a escala.
    1. Usando o software ImageJ, abra a imagem da escala definida (clique em Arquivo | abrir).
    2. Selecione o seletor de linha reta na barra de ferramentas e, usando o mouse, arraste uma linha pela extensão da escala definida na imagem.
    3. Defina a escala selecionando Analisar | Defina a escala e aguarde até que a janela Definir escala seja aberta.
    4. Na janela Definir escala, preencha o espaço em branco de Distância conhecida com a distância conhecida (μm) correspondente à reta; preencha a unidade de comprimento com um para μm. Clique em OK.
      NOTA: A escala em pixels/μm é exibida na parte inferior da janela.
  3. Defina os parâmetros de medição.
    1. No software ImageJ, selecione Analisar | Defina as medidas para abrir a janela Definir medidas .
    2. Na janela Definir medidas, selecione as caixas para as medidas desejadas (ou seja, descritores de área e forma). Clique em OK.
  4. Obter o diâmetro e circularidade dos esferoides.
    1. Abrir a imagem de um esferoide (Arquivo | Aberto).
    2. Selecione a ferramenta de seleção à mão livre na barra de ferramentas e, usando o mouse, selecione o lado externo do esferoide, conforme demonstrado na Figura 3A.
      Observação : para ampliar ou reduzir a imagem, pressione a tecla Ctrl e use o mouse para rolar para baixo ou para cima, ou pressione a tecla Ctrl e use as teclas de seta para cima ou para baixo no teclado.
    3. Selecione Analisar | Medir para abrir a janela Resultados , na qual os valores medidos são exibidos.
    4. Usando o valor de área , calcule o tamanho (diâmetro) dos esferoides usando a equação (2):
      figure-protocol-2(2º)
    5. O índice de circularidade é dado na janela Resultados como "Circ.", e é calculado automaticamente pelo software usando a equação (3):
      figure-protocol-3(3º)
      NOTA: O índice de circularidade de 1,0 representa uma forma esferoidal perfeita, enquanto um valor próximo de 0,0 indica uma forma alongada13.

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Resultados

Esferoides únicos por poço com tamanho e forma estáveis são formados por este método. A Figura 2 ilustra o processo de formação de esferoides simples de células ZFL e ZEM2S em um poço de uma placa ULA sob agitação orbital (70 rpm). As linhagens celulares ZFL e ZEM2S apresentam comportamentos diferentes em cultura 3D. A linhagem celular ZEM2S apresenta características que conferem a capacidade de formar prontamente uma forma esferoidal desde o primeiro dia de agitação orbital (Figura

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Discussão

Este é um método simples, fácil e rápido para gerar esferoides de linhagens celulares de fígado e embrião de peixe-zebra. Este método foi desenvolvido por este grupo com base em modificações de métodos esferoides 3D existentes para superar problemas relatados em estudos científicos relacionados à formação de esferoides, bem como incertezas na precisão dos dados de ensaios esferoides 3D. Por exemplo, os problemas relatados residem nas dificuldades de manuseio, na demora na geração de esferoides, na necessidade de selecion...

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Divulgações

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Agradecimentos

Em memória do Dr. Márcio Lorencini, coautor deste trabalho, excelente pesquisador na área de cosméticos e dedicado a promover a pesquisa cosmética no Brasil. Os autores agradecem ao Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia (UFPR) pela disponibilidade dos equipamentos e pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) (Código Financeiro 001) e do Grupo Boticário.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microplaca de fixação ultrabaixa de fundo redondo transparente de 96 poços, embalada individualmente, com tampa, estérilCorning7007
DMEM, pó, glicose alta, piruvatoGibco12800-017
Ham's F-12 Nutrient Mix, póGibco21700026
HEPES (1M)Gibco15630080
Processamento e análise de imagens em Java ( ImageJ) Software 1.52p  National
Institutes of Health, EUA		Disponível em: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, póGibco41300021
Agitador orbital WarmnestKLD-350-BI22 mm de diâmetro de rotação
Dulbeccos PBS (10x) com cálcio e magnésioInvitrogen14080055
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
RPMI 1640 MédioGibco31800-014
FBS - Soro Fetal Bovino, qualificado, regiões aprovadas peloUSDA Gibco12657-029
Bicarbonato de sódio, pó,  biorreagente para biologia molecularSigma-AldrichS5761
Mancha azul de tripano (0,4%)Gibco15250-061
Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenolGibco15400054
ZEM2S linha celularATCCCRL-2147Esta linha celular foi gentilmente doada pelo Professor Dr. Michael J.
Carvan (Universidade de Wisconsin, Milwaukee, EUA)
Linha celular ZFLBCRJ256

Referências

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