Artigo de método
Este protocolo apresenta ensaios de citotoxicidade comumente utilizados (ensaios de Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red e MTT) adaptados para a avaliação da citotoxicidade em linhagens celulares de embrião de peixe-zebra (ZEM2S) e fígado (ZFL) em placas de 96 poços.
As linhagens celulares de peixes têm se tornado cada vez mais utilizadas em estudos de ecotoxicidade, e ensaios de citotoxicidade têm sido propostos como métodos para prever a toxicidade aguda de peixes. Assim, este protocolo apresenta ensaios de citotoxicidade modificados para avaliar a viabilidade celular em linhagens celulares de peixe-zebra (Danio rerio) embrionário (ZEM2S) e fígado (ZFL) em placas de 96 poços. Os desfechos de citotoxicidade avaliados são a integridade mitocondrial (ensaios de Alamar Blue [AB] e MTT), a integridade da membrana via atividade da esterase (ensaio CFDA-AM) e a integridade da membrana lisossômica (ensaio Vermelho Neutro [NR]). Após a exposição das substâncias em estudo numa placa de 96 poços, são realizados os ensaios de citotoxicidade; aqui, AB e CFDA-AM são realizados simultaneamente, seguidos de NR na mesma placa, enquanto o ensaio MTT é realizado em uma placa separada. As leituras para esses ensaios são tomadas por fluorescência para AB e CFDA-AM, e absorbância para MTT e NR. Os ensaios de citotoxicidade realizados com estas linhagens celulares de peixes podem ser utilizados para estudar a toxicidade aguda de substâncias químicas em peixes.
As substâncias químicas têm de ser testadas quanto à sua segurança para a saúde humana e para o ambiente. Biomarcadores moleculares e celulares têm sido cada vez mais considerados em avaliações de segurança para predizer efeitos em organismos vivos por agências reguladoras e/ou legislações (por exemplo, REACH, OCDE, EUA EPA)1,2, uma vez que podem preceder o desfecho adverso in vivo (por exemplo, desregulação endócrina, resposta imunológica, toxicidade aguda, fototoxicidade)3,4,5,6,7
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NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a lista de materiais utilizados neste protocolo e a Tabela 1 para a composição das soluções e meios utilizados neste protocolo.
1. Preparação das células ZFL e ZEM2S
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A Figura 3 mostra as placas dos ensaios AB, CFDA-AM, NR e MTT. Para o ensaio AB (Figura 3A), os poços em branco e os poços com nenhum ou menor número de células viáveis apresentam coloração azul e baixa fluorescência, enquanto os poços com alto número de células viáveis são rosados e apresentam altos valores de fluorescência devido à transformação da resazurina (AB) em resorufina (substância rosada) pelas células viáveis. Para o ensaio CFDA-AM, não há diferença .......
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Os ensaios de citotoxicidade são amplamente utilizados para avaliação de toxicidade in vitro, e este artigo de protocolo apresenta quatro ensaios de citotoxicidade comumente utilizados modificados para serem realizados em linhagens celulares de peixe-zebra (ou seja, densidade celular para placa de 96 poços, tempo de incubação no ensaio MTT, depleção de FBS durante a condição de exposição química e concentração máxima aceitável para o SC). Como esses ensaios quantificam a citotoxicidade por diferentes desfechos d.......
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Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Em memória do Dr. Márcio Lorencini, coautor deste trabalho, excelente pesquisador na área de cosméticos e dedicado à promoção da pesquisa cosmética no Brasil. Os autores agradecem ao Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia (UFPR) pela disponibilidade de equipamentos e pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) (Código Financeiro 001) e do Grupo Boticário.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5-CFDA, AM (Diacetato de 5-Carboxifluoresceína, Éster Acetoximetílico) | Invitrogen | C1345 | |
| Placa de cultura celular, placa de 96 poços | Sarstedt | 83.3924 | Superfície: Padrão, base plana |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Pó, glicose alta, piruvato |
| FBS - Soro Bovino Fetal, qualificado, regiões aprovadas pelo USDA | Gibco | 12657-029 | |
| Mistura de Nutrientes F-12 da Ham's, pó | Gibco | 21700026 | Pó |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Médio | Gibco | 41300021 | Pó |
| Vermelho Neutro | Pó Sigma-Aldrich | N4638 | , BioReagente, adequado para cultura de células |
| Agitador orbital | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm de diâmetro de rotação |
| Dulbeccos PBS (10X) com cálcio e magnésio | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Sal de sódio Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | Pó, BioReagente, adequado para cultura de células |
| RPMI 1640 Médio | Gibco | 31800-014 | Pó |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S5761 | Pó, bioreagente para biologia molecular |
| Brometo de Tetrazólio Azul de Tiazolil 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Mancha azul de tripano (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenol | Gibco | 15400054 | |
| linha celular ZEM2S | ATCC | CRL-2147 | Esta linha celular foi gentilmente doada pelo Professor Dr. Michael J. Carvan (Universidade de Wisconsin, Milwaukee, EUA) |
| Linha celular ZFL | BCRJ | 256 |
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