O epitélio nasal é o principal sítio de barreira encontrado por todos os patógenos respiratórios. Aqui, descrevemos métodos para usar células epiteliais nasais primárias cultivadas como culturas de interface ar-líquido (LPA) para caracterizar interações coronavírus-hospedeiro humano em um sistema fisiologicamente relevante.
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Artigo de método
Infecção de Células Epiteliais Primárias Nasais Cultivadas em Interface Ar-Líquido para Caracterizar Interações Coronavírus-Hospedeiro Humano
Neste artigo
Resumo
Resumo
Três coronavírus humanos altamente patogênicos (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) e SARS-CoV-2 (2019) - emergiram e causaram crises de saúde pública significativas nos últimos 20 anos. Quatro HCoVs adicionais causam uma parcela significativa de casos de resfriado comum a cada ano (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1), destacando a importância do estudo desses vírus em sistemas fisiologicamente relevantes. Os HCoVs entram no trato respiratório e estabelecem a infecção no epitélio nasal, o sítio primário encontrado por todos os patógenos respiratórios. Usamos um sistema primário de cultura epitelial nasal no qual amostras nasais derivadas do paciente são cultivadas em uma interface ar-líquido (LPA) para estudar as interações patógeno-hospedeiro neste importante sítio sentinela. Essas culturas recapitulam muitas características da via aérea in vivo , incluindo os tipos celulares presentes, a função ciliar e a produção de muco. Descrevemos métodos para caracterizar a replicação viral, o tropismo de células hospedeiras, a citotoxicidade induzida por vírus e a indução de imune inata em culturas nasais de LPA após infecção por HCoV, usando trabalhos recentes comparando HCoVs letal e sazonal como exemplo1. Uma maior compreensão das interações hospedeiro-patógeno no nariz tem o potencial de fornecer novos alvos para a terapêutica antiviral contra HCoVs e outros vírus respiratórios que provavelmente surgirão no futuro.
Introdução
Sete coronavírus humanos (HCoVs) foram identificados até o momento e causam uma série de doenças respiratórias2. Os HCoVs comuns ou sazonais (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1) são tipicamente associados à patologia do trato respiratório superior e causam cerca de 10%-30% dos casos de resfriado comum anualmente. Embora esse seja o fenótipo clínico típico associado ao HCoVs, esses vírus podem causar doença mais significativa do trato respiratório inferior em populações de risco, incluindo crianças, idosos e indivíduos imunocomprometidos 3,4. Três HCoVs patogênicos surgiram e causaram emerg....
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Protocolo
O uso de espécimes nasais foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia (protocolo # 800614) e pelo Comitê de Revisão Institucional da Filadélfia VA (protocolo # 00781).
1. Infecção de culturas nasais de LPA
NOTA: A aquisição de espécimes clínicos, bem como o crescimento e diferenciação de culturas nasais de LPA, está fora do escopo deste trabalho. Métodos específicos para a cultura de células epiteliais nasais primárias podem ser encontrados em trabalhos publicados recentemente utilizando essas culturas18,22,23.
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Resultados
Os números representativos são parcialmente adaptados a partir de dados que podem ser encontrados no manuscrito Otter et al.1. Culturas nasais de LPA derivadas de quatro ou seis doadores foram infectadas com um dos quatro HCoVs (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 e HCoV-229E) de acordo com os protocolos descritos acima, e os títulos virais médios eliminados apicamente para cada vírus estão representados na Figura 1A. Enquanto todos esses quatro HCoVs se replicam produtiv.......
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Discussão
Os métodos aqui detalhados descrevem um sistema primário de cultura epitelial no qual células epiteliais nasais derivadas do paciente são cultivadas em uma interface ar-líquido e aplicadas ao estudo das interações HCoV-hospedeiro. Uma vez diferenciadas, essas culturas nasais de LPA recapitulam muitas características do epitélio nasal in vivo , incluindo uma população celular heterogênea com células ciliadas, caliciformes e basais representadas, bem como função mucociliar intacta com cílios e secreção de muco bat.......
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Divulgações
Susan Weiss faz parte dos Conselhos Consultivos Científicos da Ocugen. Noam A. Cohen é consultor da GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron e Oyster Point Pharmaceuticals e tem uma patente nos EUA, "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10.881.698 B2, WO20913112865), e um acordo de licenciamento com a GeneOne Life Sciences.
Agradecimentos
Este estudo tem as seguintes fontes de financiamento: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. e N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. e N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. e N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor anticorpos secundários (488, 594, 647) | Invitrogen | Vários | |
| BSA (albumina de soro bovino) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini inibidor de protease livre de EDTA | Roche | 11836170001 | |
| Kit de detecção de citotoxicidade | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + cálcio + magnésio | Gibco | 14040-117 | |
| Câmara de medição Endohm-6G | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Marcador de adesão de células epiteliais (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Medidor de Volt/Ohm Epitelial (TEER) (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Soro Bovino Fetal) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW Software para imagens | Olympus | Versão 4.02 | |
| HCoV-NL63 (coronavírus humano, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 anticorpo do nucleocapsídeo | Sino Biológico | 40641-V07E | |
| Coloração de Hoescht | Tampão de amostra Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 células | ATCC | CCL-7 | Para titular HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (coronavírus humano, Coronavírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV), EMC/2012) | Recursos BEI | NR-44260 | |
| MERS-CoV anticorpo nucleocapsídeo | Sino Biológico | 40068-MM10 | |
| MUC5AC anticorpo | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Microscópio confocal Fluoview | Olympus | FV1000 | |
| Coloração Phalloidin-iFluor 647 | Abcam ab176759 | ||
| PhosStop easy pack (inibidores de fosfatase) | Leitor | de placas Roche PHOSS-RO | |
| Perkin Elmer | HH34000000 | Qualquer leitor de placas ou leitor ELISA é suficiente; deve ser capaz de ler absorbância em tampão RIPA de 492 nm | |
| (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% desoxicolato; 0,1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Pode preparar internamente ou comprar |
| o Kit RNeasy Plus | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| Anticorpo do nucleocapsídeo SARS-CoV-2 | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Tipo IV β- anticorpo de tubulina Abcam | ab11315 | ||
| Células VeroCCL81 | ATCC | CCL-81 | Para titular células MERS-CoV |
| VeroE6 | ATCC | CRL-1586 | Para titular SARS-CoV-2 |
Referências
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120(2023).
- Fehr, A., Perlman, S.
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Reimpressões e permissões
