As células metaplásicas pancreáticas são precursoras de células malignas que dão origem a tumores pancreáticos. No entanto, isolar células pancreáticas viáveis intactas é um desafio. Apresentamos aqui um método eficiente para dissociação do tecido pancreático. As células podem então ser usadas para sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ou para co-cultivo bidimensional ou tridimensional.
O pâncreas inclui dois sistemas principais: o sistema endócrino, que produz e secreta hormônios, e o sistema exócrino, que responde por aproximadamente 90% do pâncreas e inclui células que produzem e secretam enzimas digestivas. As enzimas digestivas são produzidas nas células acinares pancreáticas, armazenadas em vesículas chamadas zimogênicos, e são então liberadas no duodeno através do ducto pancreático para iniciar processos metabólicos. As enzimas produzidas pelas células acinares podem matar células ou degradar o RNA livre de células. Além disso, as células acinares são frágeis, e protocolos comuns de dissociação resultam em um grande número de células mortas e proteases e RNases livres de células. Portanto, um dos maiores desafios na digestão do tecido pancreático é a recuperação de células intactas e viáveis, especialmente as células acinares. O protocolo apresentado neste artigo mostra um método em duas etapas que desenvolvemos para atender a essa necessidade. O protocolo pode ser usado para digerir pancreata normal, pancreata que inclui lesões pré-malignas ou tumores pancreáticos que incluem um grande número de células estromais e imunes.
O adenocarcinoma ductal de pâncreas (ADP) é um dos tipos de câncer maisagressivos1. Evidências clínicas apoiam a noção de que o PDAC se desenvolve a partir de células do sistema exócrino, incluindo células acinares, ao longo de muitos anos, impulsionado por mutações no proto-oncogene KRAS2.
Os tumores pancreáticos incluem muitos tipos celulares diferentes, e tem sido demonstrado que as células malignas representam apenas 20%-50% da massatumoral3. Diferentes tipos celulares interagem com as células epiteliais, suportam sua transformação e aumentam a formação e o crescimento do tumor. Eventos precoces causam metaplasia acinar, que dá origem a lesões microscópicas denominadas neoplasias intraepiteliais pancreáticas (PanINs), que podem, em alguns casos, evoluir para ADPD4.
Há uma necessidade crítica de investigar essas interações e direcionar sinais centrais. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) é um método poderoso que revela a expressão gênica em uma resolução de célula única, rastreando assim as mudanças que as células epiteliais sofrem, permitindo assim a exploração do desenvolvimento do câncer de pâncreas.
A dissecção e digestão do tecido para células isoladas é a primeira etapa de um experimento de scRNA-seq. Vários fatores tornam a digestão do tecido pancreático especialmente desafiadora: i) as células acinares são responsáveis por mais de 90% do pâncreas e as células acinares contêm grandes quantidades de enzimas digestivas, incluindo proteases e RNases que reduzem a qualidade das bibliotecas baseadas em RNA; (ii) as células acinares são muito sensíveis e podem lisar se forem usados protocolos padrão; (iii) as células acinares expressam um pequeno número de genes em níveis muito elevados. Portanto, se essas células forem lisadas durante o experimento, isso pode contaminar o perfil de expressão gênica observado de outras células; (iv) o tecido pancreático recuperado dos tumores é desmoplásico, dificultando a dissecação sem danificar as células. Assim, embora seja necessária a manutenção de alta viabilidade de todos os tipos celulares, o grande número e a sensibilidade das células acinares adicionam complexidade adicional. Esses fatores impõem dificuldades na obtenção de uma suspensão unicelular que seja mais de 80% viável e não tenha aglomerados, como é exigido para experimentos de scRNA-seq.
Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo utilizando tripsina C e colagenase P, além de monitoramento tecidual frequente. Isso suporta a dissociação para células únicas, mantendo alta viabilidade para apoiar o sucesso dos experimentos de scRNA-seq 5,6.
Neste artigo, apresentamos um protocolo para dissociação do tecido pancreático. O protocolo é simples, fácil de usar e fornece uma ferramenta para isolar células únicas viáveis do tecido pancreático em diferentes estágios durante o processo de malignidade, incluindo tumores sólidos. Em estudos anteriores, diferentes tipos de colagenases foram utilizados para digerir o pâncreas 8,9. O uso de uma colagenase muito potente, como a colagenase D, resulta em…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Avital Sarusi-Portuguez pela ajuda na análise dos dados e ao Dr. Dror Kolodkin-Gal pelo auxílio no estabelecimento do protocolo em um estudo anterior. Agradecemos a todos os membros passados e atuais do laboratório Parnas. Agradecemos à Dra. Gillian Kay e ao Dr. Michael Kanovsky pela ajuda na edição. Este projeto recebeu financiamento da bolsa da Israel Science Foundation (No. 526/18 O.P.), do Programa Alex U. Soyka e uma bolsa do Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Reagent or Resource | |||
70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
Critical Commercial Assay | |||
DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
Experimental Models: Organisms/Strains | |||
Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |