As células metaplásicas pancreáticas são precursoras de células malignas que dão origem a tumores pancreáticos. No entanto, isolar células pancreáticas viáveis intactas é um desafio. Apresentamos aqui um método eficiente para dissociação do tecido pancreático. As células podem então ser usadas para sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ou para co-cultivo bidimensional ou tridimensional.
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Artigo de método
Dissecção do tecido pancreático para isolar células únicas viáveis
Neste artigo
Resumo
Resumo
O pâncreas inclui dois sistemas principais: o sistema endócrino, que produz e secreta hormônios, e o sistema exócrino, que responde por aproximadamente 90% do pâncreas e inclui células que produzem e secretam enzimas digestivas. As enzimas digestivas são produzidas nas células acinares pancreáticas, armazenadas em vesículas chamadas zimogênicos, e são então liberadas no duodeno através do ducto pancreático para iniciar processos metabólicos. As enzimas produzidas pelas células acinares podem matar células ou degradar o RNA livre de células. Além disso, as células acinares são frágeis, e protocolos comuns de dissociação resultam em um grande número de células mortas e proteases e RNases livres de células. Portanto, um dos maiores desafios na digestão do tecido pancreático é a recuperação de células intactas e viáveis, especialmente as células acinares. O protocolo apresentado neste artigo mostra um método em duas etapas que desenvolvemos para atender a essa necessidade. O protocolo pode ser usado para digerir pancreata normal, pancreata que inclui lesões pré-malignas ou tumores pancreáticos que incluem um grande número de células estromais e imunes.
Introdução
O adenocarcinoma ductal de pâncreas (ADP) é um dos tipos de câncer maisagressivos1. Evidências clínicas apoiam a noção de que o PDAC se desenvolve a partir de células do sistema exócrino, incluindo células acinares, ao longo de muitos anos, impulsionado por mutações no proto-oncogene KRAS2.
Os tumores pancreáticos incluem muitos tipos celulares diferentes, e tem sido demonstrado que as células malignas representam apenas 20%-50% da massatumoral3. Diferentes tipos celulares interagem com as células epiteliais, suportam sua transformação e aumentam a formação e o crescime....
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Protocolo
O comitê de ética conjunto (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais) da Universidade Hebraica (Jerusalém, Israel) e do Centro Médico Hadassah (Jerusalém, Israel) aprovou o protocolo de estudo para bem-estar animal (MD-18-15417-5 "Tissue dynamics in pancreatic cancer in mouse"), e o protocolo aqui apresentado cumpriu todas as normas éticas relevantes para testes e pesquisas em animais. A Universidade Hebraica é uma associação para avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório instituto internacional credenciado.
NOTA: Os estoques de linhagem de camundongos #007908, estoque #019378 e estoque #008179 foram obtidos do....
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Resultados
Em um trabalho publicadorecentemente5, aplicamos o protocolo descrito acima para explorar os estágios iniciais do desenvolvimento do PDAC usando um modelo de camundongo. O camundongo foi geneticamente modificado para incluir as Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, que permitem a expressão de KRAS constitutivamente ativo em células acinares após injeção de tamoxifeno.
Após a luxação cervical (de a.......
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Discussão
Neste artigo, apresentamos um protocolo para dissociação do tecido pancreático. O protocolo é simples, fácil de usar e fornece uma ferramenta para isolar células únicas viáveis do tecido pancreático em diferentes estágios durante o processo de malignidade, incluindo tumores sólidos. Em estudos anteriores, diferentes tipos de colagenases foram utilizados para digerir o pâncreas 8,9. O uso de uma colagenase muito potente, como a colagenase D, resulta em uma grande .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Avital Sarusi-Portuguez pela ajuda na análise dos dados e ao Dr. Dror Kolodkin-Gal pelo auxílio no estabelecimento do protocolo em um estudo anterior. Agradecemos a todos os membros passados e atuais do laboratório Parnas. Agradecemos à Dra. Gillian Kay e ao Dr. Michael Kanovsky pela ajuda na edição. Este projeto recebeu financiamento da bolsa da Israel Science Foundation (No. 526/18 O.P.), do Programa Alex U. Soyka e uma bolsa do Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente ou Recurso | |||
| 70 µ m malha de nylon | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Modelos Experimentais: Organismos/ Cepas | |||
| de Soro Fetal Bovino Sul-Americano | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Solução Salineira Balanceada | Indústrias biológicas | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D ratos | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| kit de remoção de células mortas MACS | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Laboratório Jackson | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Tripsina C-EDTA 0,05% | Indústrias biológicas | cat# 03-053-1A | |
| Tripsina inibidor | Roche | cat#T6522 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117....
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Reimpressões e permissões
