Dissecção do tecido pancreático para isolar células únicas viáveis

Summary

As células metaplásicas pancreáticas são precursoras de células malignas que dão origem a tumores pancreáticos. No entanto, isolar células pancreáticas viáveis intactas é um desafio. Apresentamos aqui um método eficiente para dissociação do tecido pancreático. As células podem então ser usadas para sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ou para co-cultivo bidimensional ou tridimensional.

Abstract

O pâncreas inclui dois sistemas principais: o sistema endócrino, que produz e secreta hormônios, e o sistema exócrino, que responde por aproximadamente 90% do pâncreas e inclui células que produzem e secretam enzimas digestivas. As enzimas digestivas são produzidas nas células acinares pancreáticas, armazenadas em vesículas chamadas zimogênicos, e são então liberadas no duodeno através do ducto pancreático para iniciar processos metabólicos. As enzimas produzidas pelas células acinares podem matar células ou degradar o RNA livre de células. Além disso, as células acinares são frágeis, e protocolos comuns de dissociação resultam em um grande número de células mortas e proteases e RNases livres de células. Portanto, um dos maiores desafios na digestão do tecido pancreático é a recuperação de células intactas e viáveis, especialmente as células acinares. O protocolo apresentado neste artigo mostra um método em duas etapas que desenvolvemos para atender a essa necessidade. O protocolo pode ser usado para digerir pancreata normal, pancreata que inclui lesões pré-malignas ou tumores pancreáticos que incluem um grande número de células estromais e imunes.

Introduction

O adenocarcinoma ductal de pâncreas (ADP) é um dos tipos de câncer mais^agressivos1. Evidências clínicas apoiam a noção de que o PDAC se desenvolve a partir de células do sistema exócrino, incluindo células acinares, ao longo de muitos anos, impulsionado por mutações no proto-oncogene KRAS².

Os tumores pancreáticos incluem muitos tipos celulares diferentes, e tem sido demonstrado que as células malignas representam apenas 20%-50% da massa^tumoral3. Diferentes tipos celulares interagem com as células epiteliais, suportam sua transformação e aumentam a formação e o crescimento do tumor. Eventos precoces causam metaplasia acinar, que dá origem a lesões microscópicas denominadas neoplasias intraepiteliais pancreáticas (PanINs), que podem, em alguns casos, evoluir para ADPD4.

Há uma necessidade crítica de investigar essas interações e direcionar sinais centrais. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) é um método poderoso que revela a expressão gênica em uma resolução de célula única, rastreando assim as mudanças que as células epiteliais sofrem, permitindo assim a exploração do desenvolvimento do câncer de pâncreas.

A dissecção e digestão do tecido para células isoladas é a primeira etapa de um experimento de scRNA-seq. Vários fatores tornam a digestão do tecido pancreático especialmente desafiadora: i) as células acinares são responsáveis por mais de 90% do pâncreas e as células acinares contêm grandes quantidades de enzimas digestivas, incluindo proteases e RNases que reduzem a qualidade das bibliotecas baseadas em RNA; (ii) as células acinares são muito sensíveis e podem lisar se forem usados protocolos padrão; (iii) as células acinares expressam um pequeno número de genes em níveis muito elevados. Portanto, se essas células forem lisadas durante o experimento, isso pode contaminar o perfil de expressão gênica observado de outras células; (iv) o tecido pancreático recuperado dos tumores é desmoplásico, dificultando a dissecação sem danificar as células. Assim, embora seja necessária a manutenção de alta viabilidade de todos os tipos celulares, o grande número e a sensibilidade das células acinares adicionam complexidade adicional. Esses fatores impõem dificuldades na obtenção de uma suspensão unicelular que seja mais de 80% viável e não tenha aglomerados, como é exigido para experimentos de scRNA-seq.

Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo utilizando tripsina C e colagenase P, além de monitoramento tecidual frequente. Isso suporta a dissociação para células únicas, mantendo alta viabilidade para apoiar o sucesso dos experimentos de scRNA-seq ^5,6.

Protocol

O comitê de ética conjunto (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais) da Universidade Hebraica (Jerusalém, Israel) e do Centro Médico Hadassah (Jerusalém, Israel) aprovou o protocolo de estudo para bem-estar animal (MD-18-15417-5 "Tissue dynamics in pancreatic cancer in mouse"), e o protocolo aqui apresentado cumpriu todas as normas éticas relevantes para testes e pesquisas em animais. A Universidade Hebraica é uma associação para avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório instituto internacional credenciado.

NOTA: Os estoques de linhagem de camundongos #007908, estoque #019378 e estoque #008179 foram obtidos do laboratório de Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-Cre^ER; Rosa26^LSL-tdTomato) foram criados cruzando as cepas acima. Camundongos de ambos os sexos, entre 6 semanas e 15 meses de idade, foram utilizados para o estudo. O tamoxifeno foi preparado pela dissolução do pó em óleo de milho. Camundongos adultos (6-8 semanas de idade, fêmeas e machos) foram injetados com tamoxifeno por via subcutânea nos dias 0 e 2 na dose de 400 mg/kg e examinados duas vezes por semana após a injeção. Não foi possível mensurar os tumores por estarem localizados internamente; portanto, a eutanásia foi realizada se sinais clínicos anormais fossem observados de acordo com o protocolo ético. Os camundongos foram eutanasiados em diferentes momentos após a indução com tamoxifeno, utilizando isoflurano e deslocamento cervical.

1. Dissecção pancreática

NOTA: Para um rendimento ideal durante a extracção e para garantir uma boa viabilidade celular, a dissecção rápida é crítica. Para encurtar o tempo necessário para o isolamento do pâncreas, todos os instrumentos e equipamentos devem estar prontos no gelo antes da eutanásia do rato.

1. Eutanásia do camundongo por asfixia por CO₂ e verificação por deslocamento cervical. A partir desta etapa, todos os procedimentos devem ser realizados com instrumentos dissecadores estéreis.
2. Fixe o rato e borrife o abdómen com etanol a 70%. Faça uma incisão em forma de V de 2,5 cm na área genital com tesoura e pinça e prossiga para cima para abrir totalmente a cavidade abdominal.
3. Localize o estômago no lado esquerdo do mouse. Localize o pâncreas, que está perto do baço. Separe o pâncreas do estômago e duodeno usando duas pinças (sem rasgar). Continue e separe o pâncreas do intestino delgado, jejuno e íleo.
4. Mova o pâncreas para o lado direito do mouse. Separe as conexões restantes entre o pâncreas e a cavidade torácica com pinças para desprender completamente o pâncreas e o baço aderido.
5. Retire o pâncreas e espalhe-o para exame em uma placa de Petri sobre gelo.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado durante esta etapa para remover apenas o pâncreas, e não remover o tecido adiposo mesentérico ou outro tecido adjacente juntamente com o pâncreas, para evitar a contaminação celular.

2. Dissociação enzimática e mecânica do pâncreas

1. Prepare os seguintes buffers com antecedência.
   1. Tampão de dissociação 1: 4 ml de tripsina C + 6 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (ver Tabela 1) para cada amostra.
   2. Tampão de dissociação 2: 9 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) 1x; 4% de albumina de soro bovino (BSA); 1 mL de colagenase P (10 mg/mL); 200 μL de inibidor de tripsina (10 mg/mL); e 200 μL de DNase I (10 mg/mL) ( Tabela 1).
   3. Tampão de lavagem: 50 mL de HBSS 1x; 2 g de BSA; 1 mL de inibidor de tripsina (10 mg/mL); e 1 mL de DNase 1 (10 mg/mL).
   4. Solução de parada de atividade enzimática: HBSS 1x contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) e 150 g de DNase I (0,2 mg/mL).
2. Coloque o pâncreas em um tubo de 50 mL sobre gelo. Enxaguar o pâncreas em FBS a 10% em HBSS 1x. O tecido gorduroso flutuará e o pâncreas afundará. Esta é uma maneira fácil de visualizar e remover rapidamente o tecido adiposo branco contaminante ainda aderido ao pâncreas.
3. Transfira o tecido pancreático de camundongo para uma placa de Petri estéril contendo 5 mL de HBSS 1x em gelo. Cortar o pâncreas em pequenos pedaços de 1 a 3 mm³ com tesoura Noyes e bisturi (Figura 2A). No caso de mais de uma amostra, as amostras devem ser mantidas em gelo em FBS/HBSS 1x a 10%.
4. Transfira os tecidos para um tubo de centrífuga. Centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min. Aspirar e descartar o sobrenadante para remover fragmentos celulares e células sanguíneas.
5. Ressuspender as peças em tampão de dissociação 1 contendo 0,02% de tripsina C-0,05% EDTA por 10 min a 37 °C com agitação (180 rpm). Lavar imediatamente com 10% de FBS/meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Centrifugar durante 5 min a 350 g a 4 °C.
6. Lavar novamente ressuspendendo o pellet em 10 mL de tampão de lavagem e centrifugando a 350 x g por 5 min a 4 °C antes da próxima etapa de dissociação.
7. Incubar o pâncreas em tampão de dissociação 2 durante 15 min a 37 °C com agitação (180 rpm).
8. Após 15 min, realizar dissociação mecânica pipetando vigorosamente os fragmentos pancreáticos para cima e para baixo em pipetas estéreis de tamanho decrescente (pipetas sorológicas de 25, 10 e 5 mL) 10 vezes e trazer de volta a 37 °C.
   1. Após mais 5 min, repetir a dissociação mecânica e utilizar microscopia óptica para monitorar a dissociação de acordo com a quantidade de suspensão unicelular. Normalmente, se nesta fase, menos de 90% da suspensão consiste em células isoladas únicas, um tempo de incubação mais longo é necessário. Use o azul de tripano para monitorar a viabilidade celular.
   2. Continue com a incubação e colete amostras para detectar a dissociação a cada 5 min.
      NOTA: O tempo total de incubação depende do tecido e pode variar entre as amostras. A incubação e dissociação tecidual deve terminar quando 90% das células são separadas em células únicas ou quando uma redução na viabilidade é detectada.
9. Após a dissociação do tecido pancreático (correspondendo ao desaparecimento dos fragmentos pancreáticos e ao aumento da turbidez da solução) (Figura 2), interromper a reação enzimática lavando duas vezes com a solução de parada de atividade enzimática por 5 min a 4 °C. A partir desta etapa, mantenha a suspensão da célula no gelo.
10. Passar a suspensão celular através de uma tela de nylon de 70μm e verificar a viabilidade celular ao microscópio. Tamanhos menores de tela de nylon podem reduzir a viabilidade celular.
11. Ressuspenda e lave o pellet com 5-10 mL de solução tamponada gelada. Conte as células.
12. Se forem observados vários glóbulos vermelhos, trate as células com um tampão de lise de glóbulos vermelhos durante 2 minutos à temperatura ambiente. Nos casos em que se observam aglomerações, a amostra deve ser novamente tratada com tripsina, conforme descrito na etapa 2.5. A viabilidade é detectada com azul de tripano ao microscópio e, se a viabilidade for inferior a 80%, as células vivas devem ser isoladas usando o kit de remoção de células mortas de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) com colunas MACS MS (ver Tabela 1).

Results

Em um trabalho publicado^{recentemente5}, aplicamos o protocolo descrito acima para explorar os estágios iniciais do desenvolvimento do PDAC usando um modelo de camundongo. O camundongo foi geneticamente modificado para incluir as Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato⁷, que permitem a expressão de KRAS constitutivamente ativo em células acinares após injeção de tamoxifeno.

Após a luxação cervical (de a...

Discussion

Neste artigo, apresentamos um protocolo para dissociação do tecido pancreático. O protocolo é simples, fácil de usar e fornece uma ferramenta para isolar células únicas viáveis do tecido pancreático em diferentes estágios durante o processo de malignidade, incluindo tumores sólidos. Em estudos anteriores, diferentes tipos de colagenases foram utilizados para digerir o pâncreas ^8,9. O uso de uma colagenase muito potente, como a colagenase D, resulta em uma grande ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente ou Recurso
70 µ m malha de nylon	Corning	cat##431751
BSA	Sigma Aldrich	cat# A7906
Collagenase P	Roche	cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPI	Sigma Aldrich	cat#MBD0015
Dnase I	Roche	cat# 10104159001
Modelos Experimentais: Organismos/ Cepas
de Soro Fetal Bovino Sul-Americano	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Solução Salineira Balanceada	Indústrias biológicas	cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D ratos	Jackson Laboratory	JAX008179
kit de remoção de células mortas MACS	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER mice	Laboratório Jackson	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Tripsina C-EDTA 0,05%	Indústrias biológicas	cat# 03-053-1A
Tripsina inibidor	Roche	cat#T6522