Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

Resumo

A metodologia descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (MoDCs) e sua aplicação na avaliação in vitro de candidatos antigênicos durante o desenvolvimento de potenciais vacinas veterinárias em bovinos.

Resumo

As células dendríticas (DCs) são as mais potentes células apresentadoras de antígenos (APCs) dentro do sistema imunológico. Eles patrulham o organismo à procura de patógenos e desempenham um papel único dentro do sistema imunológico, ligando as respostas imunes inatas e adaptativas. Essas células podem fagocitar e, em seguida, apresentar antígenos capturados para células imunes efetoras, desencadeando uma gama diversificada de respostas imunes. Este trabalho demonstra um método padronizado para a geração in vitro de células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (MoDCs) isoladas de células mononucleares do sangue periférico de bovinos (PBMCs) e sua aplicação na avaliação da imunogenicidade vacinal.

A triagem celular baseada em magnética foi usada para isolar monócitos CD14+ de CMSP, e a suplementação de meio de cultura completo com interleucina (IL)-4 e fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) foi usada para induzir a diferenciação de monócitos CD14⁺ em MoDCs virgens. A geração de MoDCs imaturas foi confirmada pela detecção da expressão dos marcadores de superfície celular do complexo principal de histocompatibilidade II (MHC II), CD86 e CD40. Uma vacina antirrábica comercialmente disponível foi usada para pulsar as CCMOs imaturas, que foram posteriormente co-cultivadas com linfócitos virgens.

A análise por citometria de fluxo das MoDCs antígeno-pulsadas e da co-cultura de linfócitos revelou estimulação da proliferação de linfócitos T através da expressão dos marcadores Ki-67, CD25, CD4 e CD8. A análise da expressão do RNAm de IFN-γ e Ki-67, por PCR quantitativo, mostrou que as MoDCs podem induzir o priming antígeno-específico de linfócitos neste sistema de co-cultivo in vitro . Além disso, a secreção de IFN-γ avaliada por ELISA mostrou um título significativamente maior (**p < 0,01) na co-cultura MoDC-linfócito pulsada pela vacina antirrábica do que na co-cultura de linfócitos MoDC não pulsada por antígeno. Estes resultados mostram a validade deste ensaio in vitro MoDC para medir a imunogenicidade vacinal, o que significa que este ensaio pode ser usado para identificar potenciais candidatos vacinais para bovinos antes de prosseguir com ensaios in vivo , bem como em avaliações de imunogenicidade vacinal de vacinas comerciais.

Introdução

A vacinação veterinária representa um aspecto crucial da pecuária e da saúde, pois contribui para melhorar a segurança alimentar e o bem-estar animal, conferindo proteção contra doenças que afetam o setor pecuário globalmente¹. Um método in vitro eficaz para avaliar a imunogenicidade de possíveis candidatas a vacinas ajudaria a acelerar o processo de desenvolvimento e produção de vacinas. Faz-se necessário, portanto, ampliar o campo dos ensaios imunológicos com metodologias inovadoras baseadas em estudos in vitro , pois isso ajudaria a desvendar a complexidade dos processos imunes relacionados à imunização e infecção por patóg....

Protocolo

A colheita de sangue é realizada por um serviço veterinário certificado de acordo com as orientações éticas da Agência Austríaca para a Saúde e a Segurança dos Alimentos (AGES) e em conformidade com as normas de bem-estar animal aceites³². O estudo recebeu aprovação ética do Ministério da Agricultura da Áustria. O planejamento experimental para geração de MoDCs e sua posterior aplicação está ilustrado na Figura 1.

1. Produção de MoDCs ingênuos

OBS: Amostras de sangue total foram obtidas de um único bezerro livre de patógenos por punção da veia j....

Resultados

Esta metodologia descreve a geração in vitro de MoDCs bovinos para a avaliação de antígenos vacinais candidatos antes da realização de estudos in vivo. A Figura 1 ilustra o esquema experimental de geração de MoDC bovina e a aplicação das MoDCs para o ensaio in vitro. Utilizando a técnica de triagem celular de base magnética, foi possível coletar aproximadamente 26 milhões de miócitos CD14⁺ das CMSP colhidas, que foram previamente isoladas de 50 mL de san.......

Discussão

Este estudo demonstra um método padronizado in vitro para geração e fenotipagem de MoDCs bovinas e seu uso subsequente na medição da imunogenicidade vacinal de uma vacina comercial (por exemplo, RV). MoDCs bovinas podem ser usadas como uma ferramenta para rastrear antígenos vacinais potenciais contra doenças de bovinos e prever seu potencial impacto clínico com base em respostas imunes antes de prosseguir para testes in vivo em animais. As MoDCs geradas foram identificadas com base em suas característic.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ACK Lysing	Buffer Gibco, Thermo Fisher	A1049201	tampão de cloreto de amônio-potássio para lise de hemácias residuais em
tubos de heparina de vacutainer	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, aditivo heparina sódica 158 unidades USP, tubo de vidro, tamanho 16 x 100 mm
Kit de crescimento de células dendríticas bovinas	Bio-Rad, Reino Unido	PBP015KZZ	Coquetel de citocinas composto por IL-4 bovino recombinante e
IFN-gama bovino GM-CSF; Kit ELISA	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit uso para medir IFN-&gama; expressão em cultura sobrenadante
CD14 Anticorpo	Bio-Rad	MCA2678F	Camundongo anti-bovino CD14 monoclonal, clone CC-G33, isotipo IgG1
CD25 Anticorpo	Bio-Rad	MCA2430PE	camundongo anti bovino CD25 monoclonal, clone IL-A11, isotipo IgG1
CD4 Anticorpo	Bio-Rad	MCA1653A647	Anticorpo monoclonal CD4 bovino de camundongo, clone CC8, anticorpo IgG2a
CD40	isotipo Bio-Rad	MCA2431F	anticorpo monoclonal CD40 bovino de camundongo, clone IL-A156, anticorpo IgG1
CD8	Bio-Rad	MCA837F	anticorpo monoclonal CD8 bovino de camundongo, clone CC63, anticorpo anticorpo IgG2a
CD86	Bio-Rad	MCA2437PE	Anticorpo monoclonal CD86 anti-bovino de camundongo, clone IL-A190, isotipo IgG1
CFX96 Touch Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real	Bio-Rad-Thermal		cycler Máquina de PCR
Tubo de Centrífuga	Corning Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL e 50 mL, fundo cônico de poypropileno de alta clareza, graduado, estéril, tampa de rosca de vedação, tubo de falcão
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Kit de fixação/permeabilização com BD golgiPlug, uso para coloração de células de citômetro de fluxo
Etanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute para análise EMSURE  ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, inactivated Ficoll
Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	Meio de isolamento de linfócitos
Agente de limpeza FlowClean	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	-	Citômetro de fluxo Software de histograma
FlowTubes/ FACS  (Classificação de célula única ativada por fluorescência) Tubo	Falcon Corning	352235	Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo esterial de 5 mL com tampa de pressão do filtro de células, uso em análise de citometria de fluxo
Fluoresceinisotiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Alemanha	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Citômetro de Fluxo	Máquina de citômetro de fluxo	Beckman Coulter-Placas
de PCR de 96 poços	Bio-Rad	HSP9601	96 poços, perfil baixo, parede fina, rodapé, branco/claro
MicroBeads humanos CD14	Miltenyi Bioteck, Alemanha	130-050-201	Microbeads de 2 mL conjugados ao isotipo monoclonal IgG2a do anticorpo anti-humano CD14, usado para a seleção de monócitos bovinos de PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter,		Germany-Citômetro de fluxo multicolor software de análise de dados
MACS Coluna	Miltenyi Bioteck, Alemanha	130-042-401	Classificação de células ativadas magnéticas ou coluna de separação de células magentic imune para separação de várias populações de células CD14 com base em antígenos de superfície celular
MHC Classe II DQ DR Anticorpo Polimórfico	Bio-Rad	MCA2228F	Camundongo anti-ovelhas MHC Classe II DQ DR Polimórfico: FITC, clone 49.1, isotipo IgG2a, reativo cruzado com
tubo de microcentrífuga	Sigma Aldrich	HS4325	1,5 mL, fundo cônico, graduado, tubo estéril
Microsoft Power Point		Microsoft-As	ilustrações gráficas do projeto experimental
Controle Negativo IgG1 de Mouse:FITC para CD14, Anticorpo CD40	Bio-Rad	MCA928F	Controle isotípico CD14 e anticorpo monoclonal CD40
Controle Negativo de IgG1 de Camundongo: PE para Anticorpo CD86	Bio-Rad	MCA928PE	Controle de Isotipo Anticorpo monoclonal CD86
Controle Negativo de IgG1 em Camundongo: RPE para Anticorpo CD25	Bio-Rad	MCA928PE	Controle de Isotipo Anticorpo monoclonal CD25
Controle Negativo de IgG2a de Camundongo: FITC para Anticorpo MHC Classe II	Bio-Rad	MCA929F	Controle de isotipo para anticorpo monoclonal MHC classe II
Nobivac Raiva	MSD Saúde Animal, UK-1		µ L/mL de vacina inativada cultivada em células contendo > 2 UI/mL Cepa do vírus da raiva
Selos ópticos	Bi0-Rad	TCS0803	0,2 mL tubo de PCR plano 8 tiras de tampa, óptico, ultraclaro, compatível para máquina de qPCR
Penicilina-estreptomicina	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Tampão fosfato solução salina (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7,4, concentração
de 1xPrism - Software GraphPad 5	Dotmatics-Statistical		software
Anticorpo anti-humano Ki-67 purificado	Biolegend, EUA	350501	Anticorpo monoclonal, reativo cruzado com vaca, clone ki-67
Camundongo purificado IgG1 k Isotipo Ctrl Anticorpo	Biolegend	400101	Controle de isotipo para anticorpo monoclonal Ki-67
READIDROP Iodeto de propídio	BD Bio Sciences	1351101	Marcador de células vivas/mortas usado para citometria de fluxo, corante reativo de amina
Proteína IL-2 humana recombinante	R& D System, EUA	202-IL-010/CF	Interleucina-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Uso do kit para extração de RNA total; Buffer RLT = buffer de lise; Tampão RW1 = tampão de lavagem rigoroso contendo guanidina; Buffer RDD = buffer DNase; Tampão EPR = tampão de lavagem suave; RNaseOUT = inibidor de RNase.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Meios de cultura celular com L-glutamina e bicarbonato de sódio
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier-Licenciado		sob uma licença Creative Commons atribuição 3.0 não adaptada
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatinas dNTPs, Ss07d fusão polimerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, corantes de normalização ROX.
Sistema de Síntese de Fita Inicial SuperScript III	Invitrogen, Kit	de 18080051	para síntese de cDNA
Placa de teste de cultura de tecidos 24	TPP, Suíça	92024	Placa de 24 poços, esterilizada por radiação, tratamento com crescimento aprimorado, volume 3,18 mL
Solução de Azul de Tripano	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0,4%, 100 mL, corante para avaliar a viabilidade celular
Água Destilada UltraPure DNase/RNase-Free	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µ m água destilada filtrada por membrana
Tubos de Coleta de Sangue de Heparina VACUETTE	Thermo Fisher Scientific	15206067	Os Tubos de Coleta de Sangue de Heparina VACUETTE têm um topo verde e contêm heparina de lítio, sódio ou amônio secas por pulverização nas paredes internas e são usados em química clínica, imunologia e sorologia. O anticoagulante heparina ativa a antitrombina, que bloqueia a cascata de coagulação e, assim, produz uma amostra de sangue/plasma total.
Água	Sigma Aldrich	W3500-1L	Filtrado estéril, bioReagente adequado para cultura de células