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Na última década, há um aumento no interesse na aplicação de microscopia Raman coerente (CRM) a imagens de células e tecidos 1,2. O CRM é uma poderosa técnica de imagem química com duas variantes populares: microscopia coerente anti-espalhamento Raman de Stokes (CARS) e microscopia de espalhamento Raman estimulado (SRS). O SRS é cada vez mais popular em comparação com o CARS porque é menos afetado pela interferência de fundo não Raman e tem uma dependência linear da concentração3. O CRM adquire informações de vibração molecular semelhantes à espectroscopia Raman, mas oferece velocidade de aquisição significativamente melhorada4. Isso é obtido por excitação vibracional coerente por meio de um par de lasers pulsados com alta intensidade de pico. Como o CRM fornece mapeamento químico espacialmente resolvido em alta resolução espacial e temporal, ele encontrou aplicações importantes no diagnóstico de câncer, metabolismo lipídico, metabolismo celular, transporte de drogas e muitos outros 5,6,7,8. No entanto, um grande gargalo que dificulta a adoção generalizada da técnica é sua complexidade técnica e falta de protocolos padronizados. Embora lasers e microscópios comerciais já estejam disponíveis, quase todos os sistemas usados atualmente no campo envolvem vários níveis de personalização de lasers, ópticas, microscópios e detectores, o que cria uma barreira significativa para pesquisadores interessados em entrar no campo ou adotar essa tecnologia. A falta de acesso impede ainda mais as aplicações biológicas. O objetivo desta coleção de métodos é fornecer exemplos detalhados e orientações sobre instrumentação, novas abordagens de imagem e aplicações de imagem de células ou tecidos in vitro / in vivo. Incluímos sete publicações de especialistas na área que estão resumidas aqui.
Clark et al. apresentam uma comparação lado a lado de SRS hiperespectral e CARS em termos de sensibilidade, resolução espacial e resolução espectral9. Ambas as técnicas são implementadas com foco espectral de lasers de femtossegundo, uma abordagem comumente empregada que usa os lasers de femtossegundo de banda larga espectralmente chirped para obter resolução Raman de banda estreita. Uma comparação direta permite a avaliação das diferenças de detecção e a seleção ideal da modalidade para diferentes aplicações de imagens químicas.
De la Cadena et al. publicam um novo método SRS multiplex que pode adquirir imagens SRS de banda largarapidamente 10. A técnica é baseada em uma detecção de amplificador de bloqueio multicanal diferencial personalizado, que permite a detecção de até 32 canais simultaneamente. Além disso, a caracterização detalhada do ruído é mostrada e um método de detecção balanceado é demonstrado para eliminar o ruído do laser. Este protocolo fornece orientação prática para usuários interessados em construir sistemas SRS multiplex.
Shi et al. demonstram o uso de corantes Raman altamente multiplexados em imagens SRS11. Com o realce pré-ressonância, eles demonstram que a SRS pode fornecer sensibilidade comparável à imunofluorescência padrão. Este método contorna o limite de canais espectralmente solúveis na imunofluorescência convencional e permite o monitoramento de muitas proteínas simultaneamente e o estudo de suas interações. Orientações detalhadas sobre o processamento da amostra e a coloração com corante Raman são fornecidas para facilitar a adoção desse método poderoso.
Miao et al. apresentam imagens vibracionais de tecido inchado e análise (VISTA), uma técnica de imagem de super-resolução que combina SRS com microscopia de expansão12. O VISTA contorna os obstáculos associados à imagem fluorescente e obtém imagens volumétricas de super-resolução sem rótulos em amostras biológicas com resolução espacial de até 78 nm. Eles exploram ainda um algoritmo de aprendizado profundo para alcançar a segmentação de vários componentes, incluindo agregados de proteínas em células e tecidos cerebrais.
Espinoza et al. apresentam o uso de imagens SRS em duas cores em tempo real de proteínas e lipídios para aplicações diagnósticasteciduais 13. A imagem SRS de duas cores pode gerar imagens equivalentes a H & E para aplicações de patologia. Este protocolo descreve os detalhes da implementação de uma técnica de modulação ortogonal e foco espectral para imagens SRS simultâneas em duas cores. A conversão de imagens SRS de duas cores em imagens pseudo-H & E também é demonstrada com tecido cerebral de camundongo para ilustrar aplicações de diagnóstico de tecidos.
Yuan et al. publicam um sistema de câmara flexível para imagens SRS de longo prazo de células vivas14. A maioria das câmaras de observação de células vivas existentes são projetadas para imagens de campo claro e fluorescência. Eles são incompatíveis com a detecção de SRS devido à necessidade de uma objetiva e condensador de alta NA. Os autores demonstram imagens SRS de lapso de tempo de 24 h com a câmara flexível, que manteve temperatura, CO2 e umidade constantes.
Por fim, Wu et al. demonstram fluorescência simultânea de dois fótons in vivo (TPEF) e imagens SRS15. Dois sistemas de laser separados são combinados para obter a sensibilidade ideal para ambas as modalidades de imagem para fornecer informações complementares. In vivo A imagem SRS do tecido tem desafios únicos devido à necessidade de epidetecção de luz despolarizada e retroespalhada. Este protocolo discute os detalhes da configuração ideal de um microscópio TPEF-SRS e como ele pode ser usado para imagens in vivo da medula espinhal do camundongo.
Esta coleção de publicações representa o estado da arte atual em instrumentação de CRM e avanços técnicos. Pesquisadores interessados no desenvolvimento de métodos e aplicações acharão esta coleção útil para comparar configurações e estabelecer benchmarks (sensibilidade, resolução, etc.) para construir ou otimizar seus próprios sistemas. As diretrizes e melhores práticas fornecidas nesses protocolos informarão as aplicações in vitro e in vivo existentes e futuras. A adoção em larga escala da tecnologia de CRM ainda aguarda aplicações importantes e inovadoras e a comercialização de soluções completas de CRM. No entanto, a padronização de abordagens e benchmarks de imagem é essencial para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade e facilitar a implementação mais ampla do CRM16.
O campo do CRM está crescendo em alta velocidade. Os desenvolvimentos técnicos que empurram a sensibilidade, especificidade e limite de resolução continuam a levar a tecnologia a novos territórios. Por exemplo, a resolução espacial do SRS está começando a ultrapassar o limite de difração17,18. A sensibilidade da SRS de pré-ressonância eletrônica está agora se aproximando da fluorescência19. Em comparação com a fluorescência, o CRM tem vantagens distintas. Por exemplo, o uso do traçado de deutério permitiu o estudo in vivo da dinâmica metabólica de pequenas moléculas em uma resolução subcelular pela primeira vez20. Com tags pequenas, é possível realizar a detecção Raman altamente multiplexada de 24 ou mais alvos rotulados21. Os avanços na inteligência artificial permitem novos recursos para CRM, aproveitando seu alto conteúdo de informações e recursos moleculares específicos para segmentar e classificar objetos com diferenças sutis de características espaciais e espectrais22. Juntos, esses avanços técnicos em CRM estão prontos para acelerar e ampliar as aplicações em imagens biológicas e biomédicas.