Apresenta-se aqui um protocolo para medir a cinética do tecido adiposo in vivo em humanos usando o método de marcação com deutério (2H).
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Artigo de método
Apresenta-se aqui um protocolo para medir a cinética do tecido adiposo in vivo em humanos usando o método de marcação com deutério (2H).
O tecido adiposo branco é um órgão altamente plástico necessário para manter a homeostase energética de todo o corpo. A massa do tecido adiposo e as mudanças na massa ou distribuição de gordura são reguladas por mudanças na síntese e quebra (ou seja, renovação) de células adiposas e triacilgliceróis. As evidências sugerem que a maneira e a magnitude da expansão do tecido adiposo subcutâneo (ou seja, hipertrofia vs. hiperplasia) e a renovação podem influenciar a saúde metabólica, pois a adipogênese tem sido implicada na patogênese da obesidade e doenças relacionadas. Apesar do papel potencial do turnover adiposo na saúde humana, há uma falta de conhecimento sobre a cinética in vivo das células adiposas. Isso se deve, em parte, à lenta taxa de renovação das células no tecido adiposo e à complexidade prática de rotular diretamente seus precursores metabólicos in vivo. Aqui, descrevemos métodos para medir a cinética adiposa in vivo e as taxas de renovação em humanos por meio do consumo de água marcada com deutério (2H). A incorporação de 2H nas porções de desoxirribonucleotídeos do DNA em pré-adipócitos e adipócitos fornece uma medida precisa da formação e morte celular (renovação adiposa). No geral, esta é uma abordagem inovadora para medir a cinética adiposa in vivo e representa um afastamento substantivo de outras avaliações in vitro .
A obesidade é uma doença caracterizada pelo excesso de tecido adiposo branco (TA) e é um fator de risco significativo para o desenvolvimento de diabetes tipo II e doença cardiovascular1. O TA branco é um órgão altamente plástico que armazena energia na forma de triacilgliceróis (TGs) e é essencial para a homeostase metabólica2. O TA branco retém a capacidade de expandir, reduzir e remodelar durante a idade adulta3, e a massa de TA é determinada por mudanças dinâmicas no volume dos adipócitos (via síntese e quebra de TG), formação contínua de adipócitos
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O Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Pennington Biomedical Research Center aprovou todos os procedimentos (# 10039-PBRC) e todos os seres humanos deram consentimento informado por escrito.
1. Período de rotulagem de oito semanas 2H2O
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O protocolo de rotulagem 2H2O (seção 1) mantém o enriquecimento próximo ao platô de 2H na água corporal dentro da faixa de 1,0% a 2,5% durante o período de rotulagem de 8 semanas10, conforme mostrado na Figura 2. Um estudo anterior utilizou o protocolo de marcação 2H2O para avaliar a cinética adiposa por meio da incorporação de 2H no DNA das células adiposas, conforme detalhado nas seções 2-8, .......
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Avaliações in vivo são necessárias para fornecer novos conhecimentos sobre a dinâmica da renovação do TA branco e seu papel na obesidade e doenças metabólicas relacionadas, já que as avaliações in vitro não abrangem o ambiente natural do TA. Embora o uso de datação retrospectiva por radiocarbono para avaliar a dinâmica adiposa tenha sido informativo 7,25, essa abordagem não é adequada para capturar mudanças dinâ.......
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Os autores agradecem ao Núcleo de Espectrometria de Massa do Pennington Biomedical Research Center.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1-metilimidazol | MilliporeSigma | 336092 | |
| 2H2O | Sigma Aldrich | ||
| Anidrido acético | Aldridge | 539996 | |
| ACK Tampão de lise (tampão de lise eritrocitária) | Quality Biological Inc (VWR) | 10128-802 | |
| Agilent 6890/5973 GC/MS | Agilent | ||
| Anti-humano CD31 (PECAM-1) Biotina | Invitrogen | 13-0319-82 | |
| Anti-humano CD34 Biotina | Invitrogen | 13-0349-82 | |
| Anti-humano CD45 | BioLegend | 304004 | |
| Antibiótico Solução Antimicótica | MilliporeSigma | A5955 | |
| Colagenase tipo 1 | Worthington Bioquímica Corporação | LS004196 | |
| Desoxirribose (2-desoxi d-ribose) | MilliporeSigma | 31170 | |
| Óxido de Deutério | MilliporeSigma | 756822 | |
| coluna DB-225 (30m, 0,25mm, 0,25um) | J& W Scientific | 122-2232 | |
| Diclorometano (DCM) | MilliporeSigma | 34856 | |
| DNA padrão (DNA do timo da panturrilha) | MilliporeSigma | D4764 | |
| Dneasy Blood and Tissue Kit (kit de extração de DNA) | Qiagen | 69504 | |
| Easy Sep Kit de Biotina Humana | Stem Cell Technologies | 17663 | |
| EasySep Seleção Positiva CD14 Humana Tecnologias de Células-Tronco de Coquetel | 18058C | ||
| Acetato de etila | Fisher | EX0241-1 | |
| Falcon 5 mL Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo | VWR | 60819-295 | |
| Ficoll-Paque Plus | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| Frascos de GC (2 mL) | de GC Fisher | C-4011-1W | |
| Fisher | C-4011-631; C-4012-530 | ||
| Ácido acético glacial | Fisher | AC14893-0010 | |
| Tubos de vidro (para hidrólise) | Fisher | 14-959-35AA | |
| HEPES tampão | ThermoFisher | 15630080 | |
| Hyclone Water, grau de biologia molecular | Thomas Scientific | SH30538.02 | |
| MEM alpha | Fisher Scientific | 32561-037 | |
| PFBHA (cloridrato de o-(2, 3, 4, 5, 6)-penatfluorobenzilhidroxilamina) | MilliporeSigma | 194484 | |
| tiras indicadoras de pH | Fisher | 987618 | |
| Ácido fosfatase | Calbiochem (VWR) | 80602-592 | |
| Nuclease S1 (de Aspergillus oryzae) | MilliporeSigma | N5661 | |
| Sulfato de sódio | MilliporeSigma | 23913 |
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