É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Monitorando Alterações em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana após Infecção Viral Usando Análise Celular em Tempo Real Baseada em Impedância

1.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/64887

⸱

5 de maio de 2023

 ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Neste artigo

Resumo

O presente estudo descreve um protocolo para monitorar as alterações nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante a infecção viral usando um sistema de análise celular em tempo real (RTCA).

Resumo

As células endoteliais revestem a superfície interna de todos os vasos sanguíneos e linfáticos, criando uma barreira semipermeável que regula a troca de fluidos e solutos entre o sangue ou a linfa e seus tecidos circundantes. A capacidade de um vírus atravessar a barreira endotelial é um importante mecanismo que facilita a disseminação do vírus no corpo humano. Muitos vírus são relatados para alterar a permeabilidade endotelial e/ou causar ruptura da barreira celular endotelial durante a infecção, o que é capaz de causar extravasamento vascular. O presente estudo descreve um protocolo de análise celular em tempo real (RTCA), usando um analisador celular comercial em tempo real para monitorar a integridade endotelial e as mudanças de permeabilidade durante a infecção pelo vírus Zika (ZIKV) das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os sinais de impedância registrados antes e após a infecção pelo VZIK foram traduzidos para valores de índice celular (IC) e analisados. O protocolo RTCA permite a detecção de efeitos transitórios na forma de alterações morfológicas celulares durante uma infecção viral. Este ensaio também pode ser útil para estudar alterações na integridade vascular de HUVECs em outros arranjos experimentais.

Introdução

As células endoteliais (CE) revestem a superfície interna de todos os vasos sanguíneos e linfáticos. Estão conectados por aderentes, tight gap junctions, criando uma barreira semipermeável entre o sangue ou a linfa e os tecidos circundantes 1,2. As junções célula-célula endotelial intactas são críticas para regular o transporte de macromoléculas, solutos e fluidos, cruciais para as atividades fisiológicas dos tecidos e órgãoscorrespondentes3. A barreira endotelial é dinâmica e modulada por estímulosespecíficos4. A ruptura ou perda da função da barreira endotelial é uma característica da fisiopatologia da doença na inflamação aguda e crônica na patogênese de muitasdoenças5,6,7, incluindo a infecção viral8,9,10,11. Para os flavivírus, verificou-se que a proteína não estrutural NS1 pode alterar a permeabilidade endotelial, por exemplo, via ruptura da camada glicocálice endotelial-símile, como resultado do aumento da expressão e ativação da catepsina L, sialidases e endoglicosidase heparinase9. No estado de doença, a integridade da monocamada endotelial é afetada e as junções célula-célula são rompidas, o que pode levar à lesão e disfunção endotelial12 e, eventualmente, manifestações patológicas disseminadas em múltiplos sistemas orgânicos13,14. A infecção viral das CE resulta em alterações nas vias de sinalização celular e no perfil de expressão gênica celular, que podem afetar as funções de barreira de fluidos, causar ruptura das CE e induzir extravasamento vascular 10,15. Descobriu-se que a infecção das CE pelo vírus Zika (VZIK) interrompe a integridade juncional que causa alterações na permeabilidade vascular e leva à disfunção da barreira endotelial, resultando em extravasamento vascular10,15. Estudos mostraram que o VZIK está ligado a defeitos congênitos graves; no entanto, pouco se sabe sobre o mecanismo exato pelo qual isso ocorre16,17. Compreender as alterações da barreira endotelial durante uma infecção é, portanto, fundamental para entender o mecanismo da doença.

As CEs são atualmente utilizadas como um importante sistema experimental modelo vascular in vitro para diversos processos fisiológicos e patológicos 18,19,20,21. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) têm sido extensivamente utilizadas como sistema celular primário não imortalizado para estudar o endotélio vascular e a biologia vascular in vitro 22,23,24,25. As HUVECs foram isoladas pela primeira vez para cultivo in vitro no início da década de 1970 a partir da veia umbilical do cordão umbilical humano26. Os HUVECs têm uma morfologia semelhante a um paralelepípedo que é facilmente feita para proliferar em laboratório. Devido à tensão de cisalhamento após ser mantida por longos períodos no estado confluente, observa-se alongamento da forma celular. As HUVECs podem ser caracterizadas pela presença de corpos de Weibel e Palade (WPB), vesículas pinocíticas, pequenas quantidades de fibrilas localizadas próximas ao núcleo, mitocôndrias com formas tubulares que raramente apresentam ramificações, núcleo elipsoide com fino padrão granular de cromatina condensada e um a três nucléolos presentes em cadanúcleo27. Embora os HUVECs apresentem numerosas características morfológicas, a identificação dos HUVECs não pode ser obtida apenas pelo exame óptico. Ensaios como a coloração por imunofluorescência do endotélio vascular (VE)-caderina, são comumente utilizados para a monitorização da integridade vascular em HUVECs 28,29,30,31.

Este estudo descreve o protocolo de análise celular em tempo real (ATR) da infecção de HUVECs. O sistema RTCA utiliza placas especializadas revestidas a ouro contendo microeletrodos que fornecem uma superfície condutora para a fixação celular. Quando as células se ligam à superfície do microeletrodo, uma barreira que impede o fluxo de elétrons através dos microeletrodos é formada. A medida da impedância gerada pelos microeletrodos pode ser utilizada para obter informações sobre alguns processos celulares, incluindo a fixação celular, proliferação e migração32. O ensaio relatado é um ensaio celular baseado em impedância que, juntamente com um analisador celular em tempo real, fornece medição contínua da proliferação de células vivas, mudanças morfológicas (como encolhimento celular) e qualidade da ligação celular de forma não invasiva e livre de marcação. Neste estudo, o analisador celular em tempo real é usado para monitorar a integridade endotelial e as alterações morfológicas das HUVECs durante a infecção pelo ZIKV. Resumidamente, o instrumento mede o fluxo de elétrons transmitidos em placas especializadas de microtitulação revestidas com microeletrodos de ouro na presença de um meio de cultura (solução eletricamente condutora). A aderência celular ou alterações no número e morfologia celular perturbam o fluxo de elétrons e causam variações de impedância que podem ser captadas pelo instrumento (Figura 1 Suplementar). A diferença entre o crescimento, proliferação e aderência do HUVEC antes e após a infecção pelo VZIK é registrada em tempo real por um sinal de impedância elétrica e, em seguida, traduzida para o valor do índice celular (IC). O valor de IC da pré-infecção é usado como linha de base para a normalização do valor de IC. As alterações nos valores de IC refletem alterações morfológicas celulares ou perda de aderência celular com a infecção33. Os resultados do estudo mostram que o protocolo RTCA permite a detecção de efeitos transitórios ou alterações morfológicas celulares durante a infecção viral em comparação com um ensaio final, como a coloração de imunofluorescência da VE-caderina. O método RTCA pode ser útil para analisar as alterações da integridade vascular do HUVEC quando da infecção por outros vírus.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Preparação celular

  1. Preparação de HUVECs
    1. Cultivar 7,5 x 105 células HUVEC/mL em um frasco de cultura celular de 75cm2 (revestido com 20 μg/mL de colágeno tipo 1) contendo 12 mL de meio de células endoteliais (MEC) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 0,01% de suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS) que contém fatores de crescimento, hormônios e proteínas necessários para a cultura de HUVECs, e penicilina-estreptomicina a 0,01% (P/S). Incubar as células em estufa de cultura celular a 37 °C com CO2 a 5% (Figura 1).

2. Configuração do experimento RTCA

  1. Verificação de resistor executado em RTCA
    1. Clique duas vezes no ícone do software RTCA na área de trabalho para iniciar o aplicativo. Uma janela de login aparecerá, digite o nome de usuário e senha para fazer login.
    2. Coloque uma placa resistora RTCA de 96 poços com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.
    3. Na guia Exp Notes do software RTCA, digite o nome do experimento, o SN do dispositivo e o tipo de dispositivo (placa QC).
    4. Na guia Layout na guia Célula do software RTCA, realce todos os poços e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados (acinzentados).
    5. Na guia Agenda do software RTCA, clique em Step_1. Digite Varreduras: 10 e Intervalo: 30 s. Clique em Aplicar. Clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software para iniciar a execução de verificação.
      NOTA: Certifique-se de que a conexão dos poços à estação RTCA está correta, observando "Placa digitalizada. Connections OK" na parte inferior da página.
  2. Execução de verificação de resistor para análise de dados
    1. Na guia Índice de Células , verifique os dados após a conclusão da execução. Todos os valores de IC devem ser menores que 0,063.
    2. Na parte inferior da guia Índice de Células , verifique os dados brutos da varredura. Os dados brutos de varredura devem exibir padrões de valores repetidos de 40,0 ± 2,0 (linhas A e H), 67,5 ± 2,5 (linhas B e G), 93,6 ± 2,9 (linhas C e F) e 117,6 ± 3,2 (linhas D e E).
    3. Para interromper a execução da verificação, clique em Placa > Placa de Liberação. A placa resistora RTCA de 96 poços está agora pronta para ser removida da estação RTCA.
  3. Obtendo leitura de fundo no RTCA
    1. Lavar a placa especializada de microeletrodos de ouro revestida com colágeno tipo 1 (revestida com 20 μg/mL de colágeno tipo 1) com 60 μL/poço de solução salina balanceada de Hank (HBSS; com bicarbonato de sódio, sem cloreto de cálcio e sulfato de magnésio) 2x.
    2. Descarte o HBSS restante e adicione 50 μL/poço de MEC. Coloque a placa especializada de microeletrodos de ouro contendo MEC com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.
    3. Na guia Notas Exp do software RTCA, digite o nome do experimento, o SN do dispositivo e o tipo de dispositivo (formato de 96 poços).
    4. Na guia Layout , na guia Célula do software RTCA, destaque os poços que serão usados e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados (esmaecidos).
    5. Na guia Agenda do software RTCA, clique em Step_1 e clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software para obter uma leitura em segundo plano.
      OBS: Verifique se a conexão dos poços está correta, observando "Placa digitalizada. Connections OK" na parte inferior da página.
    6. Uma vez obtida a leitura de fundo, a placa especializada de microeletrodo de ouro está pronta para a semeadura celular e pronta para ser removida da estação RTCA.
  4. Preparação de HUVEC na placa especializada de microeletrodo de ouro
    1. Semeando as HUVECs na placa especializada de microeletrodo de ouro com 50 μL/poço de meio condicionado, 1 x 104 células/poço (meio condicionado: MEC suplementada com 10% SFB, 0,01% ECGS e 0,01% P/S). Coloque a placa de volta na estação RTCA com o poço A1 voltado para dentro para incubação noturna em uma incubadora de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: A contagem de células foi realizada na suspensão celular com fator de diluição de dois utilizando um hemocitômetro.
    2. Na guia Agendar, clique em Adicionar uma Etapa no canto superior esquerdo. Clique em Step_2 e altere as Varreduras: 601 e Intervalo: 2 min. Clique em Step_2 e clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software.
    3. Após 20 h de incubação e quando os valores de IC na guia Gráfico de Poço mostram um platô, a placa está pronta para infecção. Na guia Agenda do software RTCA, clique em Etapa de Anulação.
    4. A placa especializada de microeletrodo de ouro está agora pronta para ser removida da estação RTCA para etapas subsequentes.

3. Infecção viral em HUVECs

  1. Diluição do vírus
    1. A cultura de estoque ZIKV é mantida a -80 °C. Para este estudo, remova o estoque de vírus mantido nos frascos criogênicos e dilua o estoque de VZIK com MEC livre de soro em tubos centrífugos de 1,5 mL para obter multiplicidade de infecções (MOIs) de 0,1 e 1.
      NOTA: O estoque de ZIKV foi previamente preparado por meio de propagação em células Vero e colheita do sobrenadante ZIKV34.
  2. Infecção da monocamada celular
    1. Remover e descartar o meio condicionado (ECM suplementado com 10% FBS, 0,01% ECGS e 0,01% P/S) de cada poço. Enxaguar cada poço com 60 μL de HBSS 2x. Inserir o HBSS com o auxílio da lateral do poço; Não dispare a monocamada celular.
    2. Trabalhando da diluição mais alta para a mais baixa, adicione 40 μL de cada amostra de vírus diluída em ECM sem soro no poço. Triplicar o poço para cada diluição e manter seis poços sem infecção (controle negativo e controle positivo trombina). Não dispare a monocamada celular; Em vez disso, adicione o vírus diluído com a ajuda do lado do poço. Use uma ponta de pipeta fresca para cada inserção.
      OBS: A trombina foi escolhida como controle positivo por poder aumentar rapidamente a permeabilidade endotelial das HUVECs.
    3. Incubar a placa numa incubadora de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 para permitir a adsorção do vírus. Espalhe a placa 5x a cada 15 min para permitir a adsorção do vírus em toda a monocamada celular.
  3. Adição do meio de cultura celular de sobreposição
    1. Após 1 h de incubação, remova e descarte a suspensão do vírus da menor concentração para a mais alta.
    2. Lavar as células infectadas com 60 μL de HBSS 2x. Sobreponha o poço com ECM suplementado com SFB a 2%. Para os poços de controle positivo, diluir a trombina a 20 U/mL com MEC suplementada com SFB a 2% e sobrepor os poços com meio de MEC contendo trombina. Não dispare a monocamada celular; em vez disso, adicione mídia de sobreposição com a ajuda do lado do poço.
  4. Colocação da placa especializada em microeletrodo de ouro infectada de volta na estação RTCA
    1. Na guia Agendar, clique em Adicionar uma Etapa no canto superior esquerdo. Clique em Step_3 e altere as Varreduras: 3.601 e Intervalo: 2 min.
    2. Clique em OK na janela pop-up exibida. Coloque a placa de microeletrodo de ouro especializado infectado com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.
    3. Clique em Step_3 e clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software.

4. Análise de dados e exportação de dados

  1. Adição de informações experimentais de cada poço
    1. Na guia Layout , clique na guia Cell (Figura 2A). Para inserir as informações da célula de destino e determinar o tipo de poço para cada poço, realce o poço e digite o nome, o número e a cor da célula de destino na parte inferior do software. Clique em Aplicar (Figura 2B).
    2. Para selecionar e determinar o tipo de poço para cada poço na guia Célula , realce o poço, selecione o tipo de poço (amostra, controle positivo ou controle negativo) e clique em Definir.
    3. Na guia Layout , clique na guia Tratamento (Figura 2C). Para inserir informações de tratamento, destaque o poço e o tipo no nome do tratamento, concentração de tratamento, unidade e cor. Clique em Aplicar (Figura 2D).
    4. Para selecionar e determinar o tipo de poço para cada poço na guia Tratamento , realce o poço, selecione o tipo de poço (amostra, controle positivo ou controle negativo) e clique em Definir.
      NOTA: Para cada seleção, vários poços podem ser destacados ao mesmo tempo.
  2. Normalização do valor do IC
    1. Clique com o botão direito do mouse à direita da guia Análise de dados e selecione Índice de células normalizado na caixa suspensa Eixo Y (Figura 3A). Na seção Eixo X na parte inferior, selecione o tempo normalizado como o último ponto de tempo medido onde a placa especializada de microeletrodo de ouro foi removida para infecção (Figura 3B).
      NOTA: O processo de normalização realizado pelo software remove a maior parte da variabilidade devido às diferenças na semeadura e fixação do poço, desde que o ponto de normalização escolhido seja antes da adição do vírus e/ou tratamento. Assim, o ponto de tempo ideal de normalização deve ser o último ponto de tempo antes da adição do vírus e/ou do tratamento. O ponto de tempo para normalizar pode ser verificado na guia Agenda em Step_2. O tempo total indicado é o tempo para normalizar (Figura 3C).
  3. Plotagem dos dados obtidos utilizando o software RTCA
    1. Na guia Análise de dados , selecione os poços a serem adicionados ao gráfico destacando os poços e clicando << em Adicionar. O índice de célula normalizado em relação ao gráfico de tempo agora está pronto para ser copiado e exportado. Certifique-se de marcar a caixa de seleção Média .
  4. Exportando dados usando o software RTCA
    1. No canto superior esquerdo do software RTCA, clique em Placa > Exportar Informações do Experimento.... Marque a caixa para selecionar os dados a serem exportados. Clique em OK.
      Observação : dados brutos (valores de CI brutos) podem ser exportados quando o índice de célula > tudo está marcado.
    2. Selecione a pasta para salvar o arquivo de exportação. Clique em SALVAR. Uma janela pop-up aparecerá indicando a exportação de informações experimentais. Quando a exportação estiver concluída, outra janela aparecerá indicando que as informações do experimento exportado estão prontas para serem visualizadas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Antes da infecção pelo ZIKV, o IC registrado para a monocamada HUVEC cultivada em uma placa de microtitulação revestida com microeletrodo de ouro era superior a 8, sugerindo fortes propriedades de aderência. Placas ou poços com índice de IC menor que 8 devem ser descartados. Os HUVECs foram então infectados com ZIKV em um MOI de 0,1 e 1, e a impedância celular foi registrada por 7 dias. O valor de IC dos HUVECs infectados com ZIKV P6-740 em um MOI de 0,1 (linha azul clara) começou a cair em 15 h pós-infecção (HPI), em co...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A infecção viral citocida em células permissivas geralmente está associada a alterações substanciais na morfologia celular e na biossíntese36. As alterações morfológicas celulares induzidas pelo vírus, como encolhimento celular, aumento celular e/ou formação de sincícios, também são conhecidas como efeitos citopáticos (EPCs), característicos de certas infecções virais37. Nas CE, o ECP foi descrito como a destruição das células e quebra das tight junctions entre cada CE, cau...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Agradecimentos

Esta pesquisa recebeu apoio do Ministério do Ensino Superior da Malásia no âmbito do programa do Centro de Excelência da Instituição Superior (HICoE) (MO002-2019) e financiamento sob o Esquema de Bolsas de Pesquisa de Longo Prazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLNest615601
37 > C incubadora com 5% de CO2SanyoMCO-18AIC
75 cm2 frasco de cultura de tecidos Corning430725U
Solução antibiótica penicilina-estreptomicina (P/S)Sciencell0503
Gabinete de segurança biológica, Classe IIHoltenHB2448
Colágeno Tipo 1SIgma-AldrichC3867
Suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS)Sciencell1052
Meio de células endoteliais (ECM)Sciencell1001
E-placa 96Agilent Technologies, Inc.
Soro fetal bovino (FBS)Sciencell0025
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)Sigma-AldrichH9394
HemocitômetroLaboroptik LTDNeubauer melhorou
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)Sciencell8000
microscópio invertidoZEISSTELAVAL 31
Latitude 3520 LaptopDell -
Micropipeta multicanal (10 - 100 µ L)Micropipetamulticanal Eppendorf 3125000036
(30 - 300 µ L)Eppendorf3125000052
Reagente reservatórioTarsonsT38-524090
Placa resistor RTCA 96Agilent Technologies, Inc.
RTCA Software Pro (Versão 2.6.1)Agilent Technologies, Inc.
Pipetas monocanal (10 - 100 µ L)Eppendorf3123000047
Pipetas monocanal (100 - 1000 e micro; L)Eppendorf3123000063
Pipetas monocanal (20 - 200 e micro; L)Eppendorf3123000055
xCELLigence Analisador de células em tempo real SP (Modelo: W380)Agilent Technologies, Inc.00380601030https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232
05232368001052323500015454433001

Referências

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690(2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12(2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642(2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517(2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753(2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603(2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978(2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126(2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579(2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Monitoramento de ImpedânciaInfecção pelo Vírus ZikaÍndice CelularPermeabilidade VascularAlterações MorfológicasProtocolo RTCA
Monitorando Alterações em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana após Infecção Viral Usando Análise Celular em Tempo Real Baseada em Impedância
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.