O presente estudo descreve um protocolo para monitorar as alterações nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante a infecção viral usando um sistema de análise celular em tempo real (RTCA).
Artigo de método
O presente estudo descreve um protocolo para monitorar as alterações nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante a infecção viral usando um sistema de análise celular em tempo real (RTCA).
As células endoteliais revestem a superfície interna de todos os vasos sanguíneos e linfáticos, criando uma barreira semipermeável que regula a troca de fluidos e solutos entre o sangue ou a linfa e seus tecidos circundantes. A capacidade de um vírus atravessar a barreira endotelial é um importante mecanismo que facilita a disseminação do vírus no corpo humano. Muitos vírus são relatados para alterar a permeabilidade endotelial e/ou causar ruptura da barreira celular endotelial durante a infecção, o que é capaz de causar extravasamento vascular. O presente estudo descreve um protocolo de análise celular em tempo real (RTCA), usando um analisador celular comercial em tempo real para monitorar a integridade endotelial e as mudanças de permeabilidade durante a infecção pelo vírus Zika (ZIKV) das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os sinais de impedância registrados antes e após a infecção pelo VZIK foram traduzidos para valores de índice celular (IC) e analisados. O protocolo RTCA permite a detecção de efeitos transitórios na forma de alterações morfológicas celulares durante uma infecção viral. Este ensaio também pode ser útil para estudar alterações na integridade vascular de HUVECs em outros arranjos experimentais.
As células endoteliais (CE) revestem a superfície interna de todos os vasos sanguíneos e linfáticos. Estão conectados por aderentes, tight gap junctions, criando uma barreira semipermeável entre o sangue ou a linfa e os tecidos circundantes 1,2. As junções célula-célula endotelial intactas são críticas para regular o transporte de macromoléculas, solutos e fluidos, cruciais para as atividades fisiológicas dos tecidos e órgãoscorrespondentes3. A barreira endotelial é dinâmica e modulada por estímulosespecíficos4. A ruptura ou perda da função da barreira endotelial....
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1. Preparação celular
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Antes da infecção pelo ZIKV, o IC registrado para a monocamada HUVEC cultivada em uma placa de microtitulação revestida com microeletrodo de ouro era superior a 8, sugerindo fortes propriedades de aderência. Placas ou poços com índice de IC menor que 8 devem ser descartados. Os HUVECs foram então infectados com ZIKV em um MOI de 0,1 e 1, e a impedância celular foi registrada por 7 dias. O valor de IC dos HUVECs infectados com ZIKV P6-740 em um MOI de 0,1 (linha azul clara) começou a cair em 15 h pós-infecção (HPI), em co.......
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A infecção viral citocida em células permissivas geralmente está associada a alterações substanciais na morfologia celular e na biossíntese36. As alterações morfológicas celulares induzidas pelo vírus, como encolhimento celular, aumento celular e/ou formação de sincícios, também são conhecidas como efeitos citopáticos (EPCs), característicos de certas infecções virais37. Nas CE, o ECP foi descrito como a destruição das células e quebra das tight junctions entre cada CE, cau.......
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Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Esta pesquisa recebeu apoio do Ministério do Ensino Superior da Malásia no âmbito do programa do Centro de Excelência da Instituição Superior (HICoE) (MO002-2019) e financiamento sob o Esquema de Bolsas de Pesquisa de Longo Prazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | Nest | 615601 | |
| 37 > C incubadora com 5% de CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 75 cm2 frasco de cultura de tecidos | Corning | 430725U | |
| Solução antibiótica penicilina-estreptomicina (P/S) | Sciencell | 0503 | |
| Gabinete de segurança biológica, Classe II | Holten | HB2448 | |
| Colágeno Tipo 1 | SIgma-Aldrich | C3867 | |
| Suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS) | Sciencell | 1052 | |
| Meio de células endoteliais (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| E-placa 96 | Agilent Technologies, Inc. | ||
| Soro fetal bovino (FBS) | Sciencell | 0025 | |
| Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | |
| Hemocitômetro | Laboroptik LTD | Neubauer melhorou | |
| Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) | Sciencell | 8000 | |
| microscópio invertido | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Latitude 3520 Laptop | Dell | - | |
| Micropipeta multicanal (10 - 100 µ L) | Micropipeta | multicanal Eppendorf 3125000036 | |
| (30 - 300 µ L) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Reagente reservatório | Tarsons | T38-524090 | |
| Placa resistor RTCA 96 | Agilent Technologies, Inc. | ||
| RTCA Software Pro (Versão 2.6.1) | Agilent Technologies, Inc. | ||
| Pipetas monocanal (10 - 100 µ L) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Pipetas monocanal (100 - 1000 e micro; L) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Pipetas monocanal (20 - 200 e micro; L) | Eppendorf | 3123000055 | |
| xCELLigence Analisador de células em tempo real SP (Modelo: W380) | Agilent Technologies, Inc. | 00380601030 | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232 |
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