Summary
このプロトコルは、そのような化合物の前臨床スクリーニングに使用できる光切り替え性抗癌ペプチドの評価に採用された一連の実験を提示します。これには、2Dおよび3D細胞培養における細胞毒性評価、 ex vivo(モデル組織)の光異性化効率の評価、および in vivo の有効性が含まれます。
Abstract
光制御された生物学的に活性な化合物は、「スマート」医薬品候補の新たなクラスです。それらは、良性の非イオン化可能な光を患者の体内の特定の場所に向けることにより、正確な時空間活性化により、全身化学療法の安全性を高めます。この論文では、光制御された生物学的に活性な化合物の光活性化の in vitro 効力と ex vivo効率、および医薬品開発の初期段階でin vivo の有効性を評価するための一連の方法を示します。この方法論は、抗癌細胞傷害性ペプチド、すなわち既知の抗生物質であるグラミシジンSのジアリールエテン含有類似体に適用される。実験は、免疫適格マウスにおける癌細胞株(ルイス肺癌、LLC)、生きた組織代理(豚肉ミンチ)、および同種移植癌モデル(皮下LLC)の2D(接着細胞)および3D(スフェロイド)細胞培養を使用して実行されます。最も効果的な化合物の選択と現実的な光線治療ウィンドウの推定は、自動蛍光顕微鏡によって行われます。さまざまな照明レジメンでの光活性化効率は、モデル組織のさまざまな深さで決定され、最適な光線量が最終的な治療 的in vivo 実験に適用されます。
Introduction
光制御された生物学的に活性な化合物は、ヒト疾患に対する安全な化学療法の有望な成分として、また悪性固形腫瘍を特異的に根絶するために、ここ数十年で登場しました1。これらの化合物は可逆的に光異性化可能なフラグメント(分子光スイッチ)を含み、異なる波長の光を照射すると不活性な光異性体と活性な光異性体を切り替えることができます。
光制御性のない類似体と比較して、光制御薬は、活性が低く本質的に毒性のない形で患者の体内に全身的に導入でき、腫瘍、潰瘍、創傷などの必要な場合にのみ光によって活性化されるため、より安全である可能性があります。このような分子医薬品のプロトタイプの複数のエキサイティングなデモンストレーションは、最近の学術論文2,3,4,5,6,7で見つけることができますが、承認された薬/医療機器/疾患の組み合わせの応用である臨床光薬理学の分野は存在しません。光薬理学はまだ創薬段階にあり、体系的な前臨床試験は不明です。
ごく最近になって、いくつかの光制御抗癌ペプチド、すなわちペプチド抗生物質グラミシジンS8の類似体に対するin vivoの安全性の利点を実証しました。これらの光制御誘導体は、ジアリールエテン(DAE)光スイッチを含み、いわゆる赤色光生成「開環」光線とUV生成「閉環」光線の間で可逆的な光誘起変換を受ける(誘導体の1つである化合物LMB002について図示)。
図1:光制御細胞傷害性ペプチドLMB002とその光異性化。 ジアリールエテンフラグメントを赤色で示す。略称:DAE =ジアリールエテン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ヒットを見つけ、ヒットtoリード最適化を実行するには、多くの場合、適切な化合物ライブラリのin vitroおよびin vivoスクリーニングが必要です9,10。ここでは、光制御化合物の細胞毒性の体系的なハイスループットスクリーニングに適した方法論を示します。また、光異性化効率を決定し、モデル組織における光線量を推定し、最もパフォーマンスの高い候補のin vivo有効性を評価します。このアプローチは、生命倫理と動物飼育の考慮事項に準拠しています。
この研究では、試験された化合物の制御されていない光異性化を回避するために、従来の前臨床方法が変更されています。本明細書においてこれらの改変方法を適用する全体的な目標は、in vitro 活性を確実に比較し、リード同定およびさらなる開発のための光切り替え可能な化合物の in vivo 有効性試験を合理化するための、簡単で迅速で統計的に有意なデータを生成する一般的な戦略を開発することである。
この戦略は、3つの連続したステップで構成されています。最初のステップでは、2次元(2D、単層)および3次元(3D、スフェロイド)細胞培養および共焦点ハイスループット自動蛍光顕微鏡を使用して、選択した光制御生物学的に活性な化合物の活性および不活性光形態の段階希釈液中のIC50 (見かけの50%細胞生存率)を測定します。光線療法ウィンドウは、2つの光形態間のIC50 差に関して比較され、最も性能の高い候補が選択される。自動顕微鏡検査やその他の細胞毒性スクリーニングプラットフォーム(アッセイ)による毒性評価には特別な利点はありません11。より複雑な細胞ベースの腫瘍モデル12 は、この段階で容易に実施することができる。
ステップ1で選択した化合物について、第2ステップは、照射されたサンプル抽出物のUV検出高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して、組織サロゲート中の活性の低い光形態の光スイッチング効率を定量することにより、照射された組織表面からの深さの関数として組織内の光スイッチング効率を現実的に推定することです。 in vivoでは 、光スイッチング効率を研究することができますが、単純な組織代理である豚ひき肉を使用することを提案します。このアプローチの妥当性をテストしました。マウスのがんモデルで in vivo での光スイッチ性化合物の変換を測定し、マウス8を用いた以前の実験で測定された深さでほぼ同じ光変換を観察しました。任意の適切な代替人工組織13、3Dバイオプリント組織/器官14、生検材料、または別の免除動物材料を使用することができる。ただし、この設定は経済的、高速、倫理的であるため、適切な妥協案です。
第3のステップは、マウス癌モデルにおける in vivo 抗癌有効性の決定である。 in vitro 実験で優れた特性を示し、モデル組織で少なくとも1〜1.5cmの深さで効率的に光スイッチングを示す化合物をこの実験用に選択します。
このプロトコルは、それらの光形態(またはそれらの光定常状態、PSS)が妥当な時間(数日以上)安定していれば、異なるタイプの光スイッチを有する化合物に適用することができる。説明のために、前述のDAE由来のLMB002が15使用される。LMB002フォトフォームは熱的に安定しており、実質的な劣化なしに少なくとも1年間-20°Cで保存できます。ルイス肺癌(LLC)細胞は、このイン ビトロ および インビボ のデモンストレーションのために選択されますが、細胞の種類に制限はありません。LLC細胞は接着性であり、3Dで容易に培養可能であり、そして腫瘍様を生成するために使用される(参考文献16に記載されているように)。 生体内 LLC細胞は転移過程をモデル化するために使用され、皮下注射後に免疫適格マウスにおいて固形腫瘍を容易に生成することができる。この in vivo 方法論は、他の癌モデルに普遍的に適用することができる17、18。この戦略の詳細な実装については、以下で説明します。
Protocol
動物の世話と実験手順は、実験動物を含む研究プロジェクトの実施に関する国内および国際的な規制に従って実施されました(ウクライナの法律「残虐行為からの動物の保護について」、実験およびその他の科学的目的で使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約(欧州条約、ストラスバーグ、1986年)、科学的目的で使用される動物の保護に関する指令2010/63 / EU)。この研究は、Bienta社の生命倫理委員会によって承認されています。これらの実験では、C57BL/6NCrlマウス(各体重約20 gの成体雌)を使用しました。特定の材料、試薬、および機器は、 材料の表に記載されています。
1. 2Dおよび3D LLC細胞培養を使用したLMB002(「リングクローズ」および「リングオープン」フォーム)のIC50 評価
- 化合物の緩衝液およびストック溶液の調製
メモ: 標準的な手順を使用してバッファーを準備します。あるいは、市販の溶液を使用してください。- 14.2 gのNa2HPO 4、2.4 gのKH 2 PO4、80 gのNaCl、および2gのKClを蒸留水1 Lに加えて、10倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。オートクレーブは10x PBSを調製し、100 mLの10x溶液を900 mLの蒸留水に加えて1x溶液に希釈します。その後、溶液を4°Cで保存する。
- 4.78 gのDPBS粉末を1 Lの蒸留水に加えて、ダルベッコのPBS(DPBS)を調製します。すべての固体が溶解するまで溶液を攪拌し、pHメーターを使用してpHを確認し、1 M NaOHまたは1 M HCl(pH 7.3〜7.4)を加えて調整します。望ましいpHレベルに達したら、滅菌キャビネット内の0.22 μm真空フィルターで培地をろ過します。4°Cで保存してください。
- 238.3 gのHEPESを蒸留水1 Lに加えて、1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を調製します。溶液のpHを1 M NaOHでpH 7.5になるまで調整します。滅菌キャビネット内の0.22 μm真空フィルターでろ過します。4°Cで保存してください。
- 10倍溶液を希釈して1xトリプシン-EDTA(EDTA=エチレンジアミン四酢酸)溶液を調製する。これを行うには、50 mL滅菌チューブ内の45 mL 1x PBS溶液に5 mLの10 x トリプシン-EDTAを追加します。4°Cで保存してください。
- 攪拌プレート上に置かれた磁気攪拌棒を有する測定シリンダーに13.4gのDMEM高グルコース粉末および3.7gのNa2CO3を1Lの蒸留水に添加することによって、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)塩基性を調製する。すべての固体が溶解するまで溶液を攪拌し、pHメーターを使用してpHを確認し、1 M NaOHまたは1 M HCl(pH 7.3〜7.4)を加えて調整します。望ましいpHに達したら、滅菌キャビネット内の0.22 μm真空フィルターで培地をろ過し、4°Cで保管します。
- 900 mLのDMEM塩基性に100 mLのウシ胎児血清(FBS)、10 mLのペニシリン-ストレプトマイシン溶液、10 mLのL-グルタミン溶液、および10 mLの1 M HEPESバッファーを加えて、DMEM完全培地を調製します。4°Cで保存してください。
- 試験化合物の原液を調製します。
- 各化合物について、リングクローズドフォトフォームで5.12 mgの2つのバッチ(LMB002など)を2つの1.5 mLマイクロ遠心チューブ(1つは透明で、もう1つは黒色の不透明壁)に計量します。2.28 mgのポジティブコントロール(例:.、グラミシジンS)を非常に透明な壁のチューブに入れます。.各サンプルに100 μLの純粋なDMSOを加え、30秒間ボルテックスします。
- 透明壁管内の原液(LMB002)に660nmレーザー(光パワー密度0.6W/cm2)をボルテックスで照射し、完全混合することにより、「閉環」から「開環」形態に光異性化する。色が濃い紫色から明るい茶色に目に見えて変わるまで続けます。アルミホイルを使用して光から保護します。
- 2D細胞培養実験-細胞の播種(1日目)
- 10 mLのDMEM完全培地をLLC細胞培養液とともにT-75フラスコから15 mL滅菌チューブに移します。残った培地を真空ポンプで吸引します。
- 細胞培養物を5 mLの1x DPBSで洗浄し、溶液を真空ポンプで吸引します。
- 細胞を3 mLの1xトリプシン-EDTA溶液で覆い、フラスコを5%CO2 雰囲気中で37°Cで2〜3分間インキュベートします。
- 1xトリプシン-EDTA溶液を含む細胞培養フラスコに6 mLのDMEM培地(滅菌チューブに予め移した)を添加してトリプシン作用を停止し、懸濁液を数回ピペッティングして細胞培養フラスコ壁から細胞を洗い流します。
- 懸濁液を15 mLチューブに移し、200 × g で4分間遠心分離します。遠心分離後、上清を真空ポンプで吸引する。チューブの底にあるセルペレットに触れないでください。
- 2 mLの新鮮なDMEM完全培地を添加し、数回ピペッティングして細胞を再懸濁します。
- 約15 μLの懸濁液を0.5 mLチューブにサンプリングし、15 μLの0.4%トリパンブルーを添加し、得られた混合物をセルカウントチャンバーに移して細胞をカウントします。
- 計数後、時点あたり25 mLの細胞懸濁液を調製します。5,000-10,000(平均8,000)LLC細胞/ウェルを200μLのDMEMに、透明な底部と黒色の不透明な壁を有する96ウェルプレートの中央60ウェルに播種する。残りの36ウェルを純粋なDMEMで満たします。
- プレートを細胞培養インキュベーターに37°C、5%CO2で一晩置きます。 底板の不均一な加熱を防ぐために、下にプラスチックプレートの蓋を使用します。
- 2D細胞培養実験-化合物添加(2日目)
- 細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、プレート内の光学顕微鏡によって細胞をモニターします。
- 滅菌キャビネット内の真空ポンプでウェルから培地を吸引します。100 μLの新鮮な予熱済みDMEM培地を加え、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。
- ポリプロピレンオートクレーブ滅菌透明プレートで試験化合物とポジティブコントロールの段階希釈液を調製します。個々の時点測定に対して次のソリューションを作成します。
注意: DMSOのストックから始めてDMEMで希釈しますが、最終的な最高濃度でDMSOの1%v / vを超えないようにしてください。- グラミシジンSの128 μM溶液を得るには、1.3 μLの20 mMストック溶液を198.7 μLのDMEMに加えます。
- 「リングオープン」形態のLMB002の256 μM溶液を得るには、1.3 μLの40 mM溶液を198.7 μLのDMEMに加えます。
- 「リングクローズ」形態のLMB002の512 μM溶液を得るには、2.6 μLの40 mMストック溶液を197.4 μLのDMEMに加えます。
- さらに3回繰り返して、各濃度ポイントを4セット取得します。各開始ウェルから100 μLを吸引し、100 μLのDMEMを含むウェルに移し、十分に混合することにより、二重希釈シリーズを調製します。
注意: 光切り替え可能な化合物を使用する場合は、逆光異性化を防ぐために照明を調整する必要があります。滅菌キャビネットの照明をオフにすることをお勧めします。 - 100 μLの予め添加されたDMEMと共に56ウェルに毎回100 μLの調製溶液を移すことによって、ウェル(5-150 μM)中の化合物の最終濃度を得る。4つのウェルに毎回100 μLのDMEMを添加し、ネガティブコントロールとして使用します。
- 制御されていない光スイッチングを防ぐために、アルミホイルまたはプラスチック保護の不透明なカバーでプレートを覆います。プレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに入れ(予備のプラスチックプレートの蓋の下に使用)、選択したインキュベーション時間(10分、60分、24時間、または72時間)します。
- 2D細胞培養実験 - 染色とイメージング(2〜5日目)
- 化合物と異なる期間インキュベートした後、化合物とともに10分および60分間インキュベートしたプレートに、ウェルあたり50 μLの染色溶液を加えます。プレートを37°Cで20分間インキュベートします。
注:8 μLの20 mM Hoechst 33342溶液(最終濃度は5 μM)、32.5 μLの1 mMヨウ化プロピジウム(PI)溶液(最終濃度は1 μM)、および650 μLの非滅菌FBSを5,810 μLの非滅菌1x PBSに加えて、時点ごとにストック染色溶液を調製します。FBSとPBSを37°Cの水浴で予熱し、細胞が温度ショックを受けないようにします。 - 20倍の対物レンズを使用して自動蛍光イメージングを実行します。
- 化合物とともに24時間(3日目)および72時間(5日目)インキュベートしたプレートについて、同じ染色およびイメージング手順(ステップ1.4.1〜1.4.2)を繰り返します。
注:典型的な2Dプレートマップを 図2に示します。
- 化合物と異なる期間インキュベートした後、化合物とともに10分および60分間インキュベートしたプレートに、ウェルあたり50 μLの染色溶液を加えます。プレートを37°Cで20分間インキュベートします。
- 3D細胞培養実験 - 細胞の播種(1日目)
注:このセクションの手順は、細胞培養の2D実験準備、テスト済み化合物とのインキュベーション、およびイメージング(ステップ1.1〜1.4)で説明した手順と同じです。ただし、この場合、細胞は、黒色の不透明な壁を持つ384ウェルの超低接着U底プレートでコンパクトな成熟スフェロイドとして調製されます。このサイズのプレートを使用すると、1回の実験で2つの化合物を比較することができます。- LLC細胞培養を用いて、2D実験プロトコルのステップ1.2.1-1.2.9を繰り返します。
- 細胞を計数した後、25mLの細胞懸濁液を調製する。384ウェルの低結合U底プレートに50 μLのDMEM中のすべてのウェルに1,000細胞を播種します。
- 40 × g で30秒間遠心分離し、プレートシェーカーで250 rpmで1分間振とうして、細胞をウェルの壁から底まで振り落とします。
- プレート底部が48時間不均一に加熱されないように、プレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに余分なプラスチックプレート蓋の上に置きます。
- 3D細胞培養実験-化合物添加(3日目)
- プレート内の細胞を顕微鏡でモニタリングし、コンパクトな成熟スフェロイドが形成されていることを確認します。
- ポリプロピレンオートクレーブ滅菌透明プレートで研究化合物の段階希釈液を調製します。この場合、追加の化合物を含めます。個々の時点測定に対して次のソリューションを作成します。
- グラミシジンSの175 μMおよび350 μM溶液を得るには、1.8 μLの20 mMストック溶液を198.2 μLのDMEMに、3.6 μLのストックを196.4 μLのDMEMにそれぞれ加えます。
- 「リングオープン」形態のLMB002の175 μMおよび350 μM溶液を得るには、1 μLの40 mMストック溶液を199 μLのDMEMに、1.8 μLのストックを198.2 μLのDMEMにそれぞれ加えます。
- 「リングクローズ」形態のLMB002の350 μ および 1,750 μM 溶液を得るには、1.8 μL の 40 mM ストック溶液を 198.2 μL の DMEM に、8.8 μL のストックを 191.2 μL の DMEM にそれぞれ加えます。
- さらに3回の反復を実行して、各濃度点を4セット取得します。各開始ウェルから20 μLを引き出し、ウェルに移し、180 μLのDMEMで十分に混合することにより、段階希釈液を取得します。
注意: 光切り替え可能な化合物を使用する場合は、逆光異性化を防ぐために照明を調整する必要があります。滅菌キャビネットの照明をオフにすることをお勧めします。 - 50 μLのDMEMを含む128個のウェルに毎回20 μLの調製溶液を移すことにより、ウェル内の化合物の最終濃度を取得します。コントロールとして機能するために、3つのウェルに毎回20 μLのDMEMを追加します。プレートをアルミホイルまたはプラスチックの保護カバーで覆い、光の切り替えや蒸発を防ぎます。
- 選択したインキュベーション時間、プラスチックプレートの蓋上の細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。
- 3D細胞培養実験-染色とイメージング(3〜6日目)
- 13 μLの1 mMカルセインAM溶液(最終濃度は1 μM)、22 μLの20 mM Hoechst 33342溶液(最終濃度は33 μM)、40 μLの1 mM PI溶液(最終濃度は3 μM)、300 μLの非滅菌FBSを2,625 μLの非滅菌1x PBSに加えて、時点ごとに染色溶液を調製します。FBSとPBSを37°Cの水浴で予熱し、細胞が温度ショックを受けないようにします。
- 化合物と異なる期間インキュベートした後、化合物とともに10分間インキュベートしたウェルにウェルあたり20 μLの染色溶液を加えます。37°Cで2時間インキュベートします。
- 20倍の対物レンズを使用して蛍光共焦点イメージングを実行します。
- 化合物とともに24時間(4日目)および72日目(6日目)インキュベートしたウェルについて、同じ染色およびイメージング手順を繰り返します。
注:この実験では、カルセインAMを多色染色溶液の第3成分として使用します。2Dおよび3D実験から得られた画像は、機器の自動画像解析ソフトウェアを使用して分析されます。Hoechst色素およびヨウ化プロピジウム色素と共染色された細胞は壊死していると見なされ、濃度の関数としてのそれらの画分を使用してIC50 値を計算します。
図2:2D培養実験の代表的なプレートマップの例。 コンパウンドとコントロールのカラーコードが示されています。試験された化合物の濃度(ウェル内の数値)はμMで示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.組織サロゲートにおける光スイッチング効率の決定
- 図3に示すように、サンプル照射用の光列(レーザー光源からの光ケーブル、焦点距離可変レンズ、不透明カバー付きシリンジ、およびフラットカットエンドで構成)を組み立てます。
- レンズの焦点距離と絞りを変えることにより、使用済みシリンジの内径より1〜1.5 mm大きいが、可能な限り絞り内にある直径の平らな光線を得る。
- 切断端が内径12.4 mmで、不透明なプラスチックカバーで覆われた5 mLシリンジを使用します。レーザー出力が200mWの場合、光度計で測定した光学系の出力のパワー密度を~103mW/cm2 に設定します。
注意: その後のすべての操作は、職場の照明を最小限に抑えた暗い部屋で実行する必要があります。 - 3 mL の LMB002 (「閉環」形態) ストック溶液を 1 mg/mL の濃度で PBS で調製します。
- LMB002の不活性フォトフォームをプラスチック容器にロードしたモデル組織サンプルを準備します。典型的な分析では、5 gの新鮮な豚ひき肉を277 μLのLMB002ストック溶液および260 μLのPBSと機械的に混合して、サンプル中の最終濃度50 mg/kgに達し、組織/PBS比は~9/1(v/v)になります。
- シリンジに準備したサンプルを満たし、気泡が内部にないことを確認し、露出(切断)端に平らな面を形成します。
注:シリンジ内のサンプルのシリンダーは、軸に沿って~40mmを占める必要があります。 - 図3に示すように、光列内のサンプルを9分44秒間、~60 J/cm2の露光に相当します。
- 露出後、ピストンを使用してシリンジから押し出し、メスで切断することにより、サンプルの厚さ4 mmのスライスを準備します。スライスを計量して別々の試験管に入れ、照射面からの平均距離(mm)でマークします。
- 試験管に2つの対照サンプル(最適量、0.5〜0.7 g)を準備します:一方のミンチ肉に10%(容量)のPBS(54 μL)を混合し、もう一方では、ステップ2.4で得られたモデル組織サンプルに500 mWのレーザー光を10分間照射して、すべてのLMB002「閉環」分子が「開環」型に変換されるようにします。
- アセトニトリルと水の混合物(70%/30% v/v、0.01%トリフルオロ酢酸(TFA)、1.4 mL/gを添加)を各スライスとコントロールサンプルに加えます。ガラス棒を使用して内容物を完全に混合します。
- 室温で少なくとも10分間インキュベートし、混合物を5220 x gで20分間遠心分離するか、20 x gで30分間遠心分離して2回不溶性物質を除去し、上清を収集します。
- 上清(~0.7 mL)を注意深く回収し、16,000 x g で30分間遠心分離します。
- 上清(各~0.5 mL)を回収し、分析用C18カラム、3.46% B/minの線形A:Bグラジエント、2.0 mL/minの流速、および100 μLの注入量を備えた逆相高速液体クロマトグラフィー(RP HPLC)で分析します。570 nm(「閉環」型の検出)および270 nm(「開環」型の検出)でUV検出クロマトグラムを記録します。非照射(ステップ2.4)および照射コントロール(ステップ2.8)サンプルを使用して、両方のフォトフォーム(溶離液A:0.1%TFA水溶液;溶離液B:90%アセトニトリル水、0,1%TFA)の特定の保持時間を決定し、メソッドを校正します。
- 既知の濃度のLMB002溶液のクロマトグラムを取得および分析して得られた検量線を使用して、分析サンプル中のLMB002フォトフォームの実際の量を決定します。キャリブレーションのために、ストック溶液(ステップ2.3)をアセトニトリルと水の混合物(0.01%TFAを添加した70%/30%v/v)で希釈してLMB002「リングクローズド」溶液を調製し、100 μL(注入量)あたり0.36、0.9、および3.6 μgを取得します。溶離液の勾配と流速はステップ2.12と同じです。
- 実験(ステップ2.4-2.12)を3回繰り返し、各フォトフォームの正規化されたパーセントをプロット(パーセンテージ)対距離(照射された組織表面から)にプロットします。統計量(つまり、各濃度点での標準偏差)を計算します。
図3:モデル組織における光変換の効率を決定するための実験セットアップ。 (A)模式図および(B)写真; 1、レーザー光源からの光ケーブル。 2、可変焦点距離のレンズ。 図3、 肉ミンチ-LMB002-リン酸緩衝生理食塩水混合物4に入れ、不透明カバー付きのシリンジを、前端を切断した(カバーなしの(B)に示す)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. 生体内 抗がん効果測定
注:実験スケジュールとエンドポイントを 図4に示します。治療後の動物の飼育基準は、3R規則に準拠する必要があります-ハウジングには、適切なケージ密度とリソースの可用性を含める必要があります。可能な限り、トンネルやカッピングなどの嫌悪感のない動物の取り扱い方法を順守してください。
図4: in vivo 治療実験のスケジュール。 実験群の指定、治療の詳細、エンドポイント、および 死後 分析スケジュール。略語:LLC =ルイス肺癌;IV =静脈内;SC =皮下。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 皮下接種のための癌細胞の調製(0日目)。
- LLC細胞をDMEM(4.5 g / Lグルコース)中で、10%FBS、100 U / mLペニシリン、および100 μg / mLストレプトマイシンで37°Cおよび5%CO2で継代します。
- 0.05%トリプシン-EDTA溶液を使用して細胞を回収し、遠心分離し、無血清DMEMに懸濁します。
- 細胞を数え、血球計算盤とトリパンブルー排除試験を使用してそれらの生存率を決定します。
- DMEMとマトリゲルミックス(1:1)で濃度10 ×10 6 細胞/ mLの最終細胞懸濁液を調製します。注射前に懸濁液を氷上に保管してください。
- LLC細胞接種(0日目)
- 成体メスのC57BL/6NCrlマウス(体重~20g)をイソフルラン麻酔器の誘導室に入れます。イソフルランの5%で鎮静を行い、動物が完全に意識を失うまで待ちます。
- 剃毛によって細胞接種の領域から毛皮を取り除きます。
- 5 ×10 5 LLC細胞を~100 μLのDMEM:マトリゲル(1:1)混合物で右後肢に接種します。
注意: 可能な限り、単針の使用方法を順守してください。
- 化合物投与と光照射
注:接種後5〜8日で、腫瘍が触知可能になり、~50〜100 mm3 の体積に達したとき、動物は治療の準備ができています。LMB002およびこの化合物で処理したマウスを半暗条件下(職場から少なくとも5 mの4 W LEDランプ1個)でその後のすべての操作を実行します。- LMB002(「閉環」形態)を滅菌生理食塩水に1 mg/mLの濃度で5 mg/kg(IV)の用量で溶解して、濃い青色の均一な溶液を得ます。
- 照射前に、8匹ずつの4群を無作為に組み立て、剃毛により腫瘍とその周辺から毛並みを取り除きます。
- マウスをIV注射用のホルダーに入れ、37°Cの水浴で動物の尾を予熱して尾静脈を見えるようにします。
注:術前鎮痛を検討してください。 - 化合物を5 mL / kgで尾静脈に注入します。2つの対照群について、動物あたり100μLの生理食塩水を(静脈内)注射する(体重20g)。2つの実験グループの動物が、不活性な光体(生理食塩水中で1 mg / mL)でテストされた化合物を受け取っていることを確認します。
注意: 可能な限り、単針の使用方法を順守してください。 - 次いで、化合物の注射から2時間45分後、マウスを麻酔下に置く。酸素中の3%〜4%イソフルランで鎮静を誘発する。酸素中の0.5%-1%イソフルランで15分間麻酔を維持します。
- 腫瘍領域のみを光にさらす穴のある黒いマスクでマウスを覆います。
- 650 nmレーザーでレーザーダイオードモジュールの電源を入れ、赤色レーザーの出力を200 mWに、青色/UVガイドレーザーの出力を2 mWに設定します。
注意: レーザーデバイスの電源が入っているときは、青い保護メガネを使用してください。 - 赤色レーザーからの光束(マウスから離れている)を光度計で測定し、光束が100 mW/cm2である光ケーブルからの距離を決定します。ケーブルをスタンドに固定して、光源が腫瘍から決定された距離にあり、光が腫瘍領域全体をカバーすることを確認します。この手順では、青色/ UVガイドレーザー光を使用してください。
- 赤色レーザーをオンにして、腫瘍領域に20分間照射します。
- 照射後、イソフルランの流れを止め、動物をケージに戻し、次の30分間にわたってその状態を注意深く観察します。
注:化合物投与後、マウスを2日間暗所に保ちます。光日のサイクルのみを変更する必要があります。他のすべての住宅条件は変更されないままであるべきです。
- 治療後の観察
- 動物を毎日観察し、腫瘍の重量と寸法を測定します。腫瘍の体積を測定し、壊死の進行に注意してください。
注:治療後の動物の飼育基準は、3R規則に準拠する必要があります-ハウジングには、適切なケージ密度とリソースの可用性を含める必要があります。 - 前の手順で収集したデータを使用して、死亡率を評価します。標準的な手順を使用して生存率を決定します。
注:重度の臨床徴候(体重減少が15%を超える、腫瘍潰瘍が7日間で治癒しない、発声)が明らかになった場合、または腫瘍の体積が2,500 mm3に達したらすぐに、動物を犠牲にして死亡としてカウントする必要があります。
- 動物を毎日観察し、腫瘍の重量と寸法を測定します。腫瘍の体積を測定し、壊死の進行に注意してください。
Representative Results
この研究では、2Dおよび3Dセル実験を実施して、異なるインキュベーション時間でのLMB002の「リングクローズ」および「リングオープン」形態のIC50 を決定しました( 図1を参照)。これらの値を、プロトタイプペプチドであるグラミシジンS(ポジティブコントロールとして使用)について得られた値と比較した。染色後の2D成長LLC培養物におけるインキュベーションの典型的な一連の画像を 図5に示す。Hoechst 33342(青)およびヨウ化プロピジウム(赤)との共染色は、「リングクローズ」と比較して「リングオープン」形態で処理した場合に、より大きな部分の細胞で異なる紫色の色合いをもたらし、容易に定量化できる2つの形態間の細胞毒性の顕著な違いを示しています。実験の成功例の実証例は、 図2に示すように、さまざまな濃度のペプチド変異体を添加した96ウェルプレートフォーマットを使用して収集されたデータに基づいています。同様のデータは、384ウェルおよび高密度プレートでも取得できます。しかしながら、ウェル当たりの容積が減少するので、技術的および系統的誤差、そしてその結果として、IC50 決定の精度は、ウェル密度の増加と共に低下するであろう。
図5:単層成長LLCにおける細胞毒性アッセイからの代表的な画像。 細胞をヘキスト33342(青)およびヨウ化プロピジウム(赤)で染色した。示されている時間:10分、60分、24時間、および72時間は、化合物とのインキュベーション時間です。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
モデル組織におけるレーザー光照射によるLMB002の光変換率-新鮮な豚ミンチ-をPBSに溶解したLMB002「閉環」(不活性)形態と混合したミンチ肉からなる試料を用いて測定し、この不活性形態から放射線伝播方向のLMB002「開環」(活性化)形態への変換を測定した。サンプルをシリンジに入れ、図3に示すように、片側からレーザー放射の平坦なビームを~10分間露光時間照射しました(通常、in vivo実験で使用されます)。暴露後、シリンジピストンを押し、メスで同じ高さのスライスを切断することにより、サンプルシリンダーを部分に分割しました。スライスからの抽出物中のLMB002「開環」の濃度をRP HPLCを用いて決定した。
図6は、データ解析から得られた 図6A〜D の用量効果曲線を示す。Hoechst 33342とPI色素の核共染色による死細胞の割合を特定するために、選択した測定パラメータに数値閾値を設定する組み込みの分類ツールを使用して、すべての細胞数をいくつかのカテゴリに分割しました。例えば、対照の赤チャネル(ヨウ化プロピジウム)シグナルが閾値(約110〜130単位)にある場合、細胞はPI陽性、死者と見なされる、またはPI陰性に分類され、化合物の影響を受けないと見なされます。LMB002については、化合物濃度に対するヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合のシグモイド依存性が見られる。これらのデータから、IC50 値を決定することができる。
図6:2D培養における細胞毒性の解析。 シグモイドは、LLC培養で得られたように(A)10分間、(B)60分間、(C)24時間、および(D)72時間間隔で化合物とのインキュベーションのために取られた。フィッティングは、IC50 値(図示せず)の正確な決定を可能にする。エラーバーはSEMです。 略語:LLC =ルイス肺癌;PI =ヨウ化プロピジウム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
得られたIC50 値を考慮すると、3つの化合物すべての毒性はインキュベーション時間とともに増加したと結論付けることができます。私たちの実験では、LMB002の「開環」型は、プロトタイプペプチドであるグラミシジンSよりも約1希釈ステップで毒性が低いことが明らかになりましたが、「閉環」型は3〜4希釈ステップで毒性が低く、インキュベーション時間とともに増加します。2つの希釈ステップ間の差は、インキュベーション時間の増加によって影響されず、潜在的なライブラリスクリーニングにおいて他の化合物と比較するための実験的に決定された光線療法ウィンドウ6 として数値的に使用することができる。グラミシジンSのIC50 値は、生物学的反復における実験誤差または差動出力を補正するための基準点として設定された。
3D細胞実験では、同じタイプの生データ、つまり単一細胞で分解されたウェルあたり1枚の回転楕円体画像が生成されました。第3の染色色素としてカルセインを含めることで、代謝的に活性な細胞(グリーンチャネルで観察)の画分の定量が可能になります。384ウェルプレートを使用し、冗長な共インキュベーション時点を除外してテクニカルレプリケート数を増やし、希釈フォールドを変更することで、 図7のプレートマップに示すように、1回のテストラン(シングルプレートを使用)で複数の化合物を直接比較することができました。
図7:2つの化合物を用いた3D培養実験のプレートマップ。 コンパウンドとコントロールのカラーコードが示されています。ウェル内の数値はμM単位の濃度であり、10分、24時間、および72時間はインキュベーション時間である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8は、染色後に捕捉された試験済み化合物および対照スフェロイドの存在下で1スフェロイド/ウェルの密度で増殖させたLLCスフェロイドの選択されたテクニカルレプリケートの画像を示しています。
図8:3D培養細胞毒性アッセイからの代表的な画像。 画像は、LMB002フォトフォームとグラミシジンSの両方と10分、24時間、および72時間の共インキュベーション後に、Hoechst 33342(青)、カルセインAM(緑)、およびヨウ化プロピジウム(赤)で染色された48時間齢のLLCスフェロイドを示しています。 スケールバー= 100μm。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
装置のソフトウェアを使用して、2D実験の場合と同様に、zスタックされた画像の山から線量効果曲線を取得しました(図9A)。さらに、3D培養におけるコンパクトで変形していないスフェロイドは、スフェロイド全体の直径によって特徴付けることができます(図9B)。また、全体のスフェロイド直径は化合物濃度によって異なることも注目された。
図9:3D培養による細胞毒性評価。 (A)グラミシジンSと10分、24時間、および72時間共インキュベートし、染色前にキャプチャしたLLCの3D培養で得られた濃度依存性細胞毒性フィッティング曲線および(B)濃度依存性スフェロイド直径プロット。エラーバーはSEMです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ステップ2の実験では、UV検出高速液体クロマトグラフィーを使用して、両方のフォトフォーム中のLMB002濃度を測定できます。モデル組織における光変換の効率は、この設定を使用して簡単に評価および定量化できました(図3)。データは、サンプル抽出物のクロマトグラムの定量分析から得られた。これらの試験実験では、LMB002クロマトグラムを270nmおよび570nmで分光的に検出した。270 nmで、多くの追加のシグナルが観察され、モデル組織から共抽出された化合物に起因しました(化合物を含まない対照抽出物から検証されました)。両方のフォトフォームは、保持時間および吸光度において十分に異なっていた。しかしながら、LMB002の「リングオープン」シグナルは、これらのバックグラウンドシグナルからベースライン分離された( 図10Aの代表的なクロマトグラムを参照)。したがって、この信号は問題なく積分できます。570 nmでは、クロマトグラムにはLMB002の「閉環」フォームシグナルのみが含まれていました(図10B)。ここでは、RP HPLCを用いて濃度測定を行った。それにもかかわらず、LC/MSを分析法として使用すると、さらに高い精度と低い検出限界を達成できます。
図10:モデル組織から抽出したLMB002の代表的なクロマトグラム。 (a)照射面から2mmで試料を、270nmで記録する(LMB002「開環」形態が一体化);(b)試料は、照射面から38mmで、570nmで記録された(LMB002「閉環」のピークが積分している)。保持時間の値(表示)は、化合物の同一性をさらに確認した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11に示すように、収集されたすべてのサンプルの対応する信号を積分した後に得られたデータを使用して、濃度-深度グラフを作成しました。これらのグラフに基づいて、モデル組織の異なる深さにおける光変換の効率を容易に評価した。これは、私たちの赤色光源が、組織サロゲートのひき肉(約103 mW / cm2)で、最大1 cの深さで「リングクローズド」LMB002光変換を誘導することを確認します。
図11:光変換効率評価。 モデル組織の照射面(L、mm)から異なる距離でのLMB002「リングクローズ」(非活性化、青色の点)および「リングオープン」フォーム(活性化、オレンジ色の点)の濃度(A、mg / kg)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4に提示されたスケジュールに従って実施されたインビボ実験(方法論のステップ3)の結果は、時間の関数としての腫瘍増殖を示すグラフ(図12)およびKaplan-Meier生存曲線(図13)によって表された。
図12:動物における腫瘍増殖動態。 LMB002で処置した動物を、賦形動物と比較した(C57BL/6NCrlマウスにおけるLLC同種移植片モデル、化合物用量7mg/kg、IV、2時間40分間のインキュベーション、次いで650nmでの照射、100mW/cm2、20分間)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図13:動物の死亡率曲線。 LMB002で処置した動物を、賦形動物と比較した(C57BL/6NCrlマウスにおけるLLC同種移植片モデル、化合物用量7mg/kg、IV、2時間40分間のインキュベーション、次いで650nmでの照射、100mW/cm2、20分間)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
光制御化合物は、医薬品開発において前例のないものです。しかし、それらの前臨床的および臨床的評価のための方法は確立されていない。最も近い単剤療法アナログである光線力学療法(PDT)は、癌に対して多くの国で採用されている臨床使用の治療法であり、他の適応症のために開発中です19,20。光薬理学と同様に、PDTも光を使用して生理活性物質(一重項酸素)を活性化することに基づいています。したがって、PDTの前臨床試験および臨床試験に使用されるいくつかの実験方法を光薬理学に採用することができます。たとえば、光源、光配信アプローチ、および医療機器は十分に開発され、PDT用に承認されています。それらは光制御薬物の評価に直接使用することができます。ただし、PDTと光薬理学には互いに多くの違いがあり4、後者の特定の方法を確立する必要性を正当化します。
第一に、PDT(酸素)中の非活性化物質は、非毒性濃度で生体組織中に常に存在する。対照的に、活性化されていない光制御生物学的活性化合物は、残存活性および望ましくない毒性を有し得る。したがって、理想的な光薬理学的薬物は、投与された形態では生物学的活性を最小限に抑え、光生成形態で非常に活性が高くなければならず、「光線療法ウィンドウ」21 は可能な限り大きくなければなりません。ヒットを見つけてヒットtoリード最適化を実行するには、すでに医薬品開発の初期段階にある、適切な化合物の同定と比較的大規模なライブラリのスクリーニングが必要です。ここでは、効率的な光スイッチング化合物を同定するための自動ハイスループット共焦点蛍光顕微鏡法を提案しました。
選択された細胞毒性評価方法は、最も重要な要件 - PSSの維持または可視光感受性光異性体の安定性 - を容易に実施することを可能にする。これは、その実装時に、光の露出が最小限に抑えられるためです。したがって、別の方法を選択する場合は、自動化された方法をお勧めします。このアプローチは信頼性が高く有益です。この段階で3D細胞培養(スフェロイド)を使用することで、より現実的な組織様微小環境での治療に対する細胞の反応を全体的に理解することができます。さらに、化合物の作用機構に関する貴重な洞察は、直接法として顕微鏡法を使用して得ることができます。適切な染色プロトコルを備えた共焦点蛍光顕微鏡法により、細胞とスフェロイドの形態を視覚的に評価できます。細胞死や細胞内の変化に関する重要な詳細も検出できます。
第二に、軽い適用は軽い投与量の慎重な選択を必要とします。PDTでは、軽い過剰摂取は組織に非常に有害です22。光薬理学的療法は、過度の光照射下で有利であり得る。活性化物質の上限は、非活性化物質の投与量およびその薬物動態によって規定される。しかし、光線量は依然として光薬理学における問題です。照射力密度と露光時間が治療 の要件以上である ことを確認するように注意する必要があります。原則として、活性化物質の生成は インビボでモニターすることができる。しかし、生命倫理上の理由から、我々はモデル組織(新鮮なひき肉)に非活性化化合物15を混合した実験を提案した。この実験は簡単で、さまざまな光源を使用するように変更できます。また、光線量の光物理学的推定や熱影響の測定にも適応できます。ここでもまた、モデル組織を用いることによって、光曝露を最小化することが可能であり、例えば、 インビボ 条件におけるより正確な光スイッチング効率決定と比較して、常に検討することが興味深いかもしれない代替案である。
最後に、in vitro 毒性スクリーニングにおいて優れた特性を示し、モデル組織において少なくとも1〜1.5cmの深さで効率的に光スイッチングする化合物は、費用がかかり、手間がかかり、時間のかかる in vivo 研究のために選択することができる。このプロトコルでは、 in vitro 評価と同じ細胞株(LLC)を使用して、同種移植がんモデルを作成しました。腫瘍増殖動態、死亡率、および転移数は、抗がん効果の評価に最も適したパラメータです。従来の化学療法と比較して、追加の要因が光薬理学的治療に適用されます - 光。したがって、2つの対照動物群、すなわち、ビヒクルのみを受け取る動物群と、ビヒクルおよび照射を受ける動物群の2つが必要である。このセットアップにより、測定パラメータに対する光の影響を評価できます。本発明者らの実験では、2つの実験群の動物に非活性化化合物を投与し、一方の群のマウスの腫瘍に放射線を照射した。照射レジームは、対照群と治療群で同一でした。実験の主な目的は、光と化合物の適用の複合効果を実証することであるため、ベンチマーク化学療法との比較はこの段階では必要ありません。次に、この効果を示す最も優れた化合物を選択して、 in vivo 毒性に関するさらなる研究と、それらの開発に関する重要な決定を下すためのベンチマークとの比較を行うことができます。技術的には、我々が説明する インビボ 実験は、例えば、薬物リードとしてすでに選択されている化合物の薬物動態学的または薬力学学的研究に容易に適合させることができる。
Disclosures
IVK、OB、SA、およびASUは、Lumobiotics GmbHにライセンス供与された「光制御生物学的活性を有するペプチド模倣薬」(WO2014127919 [A1]、EP2958934 [B1]、US9481712 [B2]、UA113685 [C2])の発明者です。 IVK、OB、TS、およびSAはLumobiotics GmbHの創設者および株主です。 IVKは科学顧問であり、HK、TM、IP、およびPBはEnamine LLCの従業員です。著者は、開示されているものを除いて、出版物で説明されている主題または資料に金銭的利益または金銭的矛盾を持つ組織または団体と他の関連する提携または財政的関与を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、ペリコ(#690973)およびALISE(#101007256)プロジェクトを通じたH2020-MSCA-RISEプログラムによるEUの資金提供を認めている。この研究は、DFG-GRK 2039(SA、TS、ASU)、ヘルムホルツ協会のNACIPプログラム(SAおよびASU)、およびBMBFのVIP+(OBおよびASU)によってサポートされました。化合物LMB002を合成し、精製し、研究のために化合物を提供してくださったカールスルーエ工科大学のSerhii Koniev博士に感謝します。著者はまた、ウクライナでビデオを撮影および編集したChupryna Maksymと、この出版物の実験的な作業、執筆、撮影を可能にしたウクライナのすべての勇敢な擁護者に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | - | |
| ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
| C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
| CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
| Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
| Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
| Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
| Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
| Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
| IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
| Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
| Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
| LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | - | |
| LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
| Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
| PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
| Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
| Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
| Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
| UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
| UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
| Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |
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