Desde o surgimento dos detectores diretos de elétrons e o aprimoramento do software e do hardware, a microscopia crioeletrônica (crio-EM) tornou-se uma técnica que rotineiramente permite aos pesquisadores determinar a estrutura das macromoléculas com detalhes quase atômicos 1,2. Essa aceleração foi catalisada por uma série extremamente rápida de novos desenvolvimentos, desde a preparação da amostra até a coleta e processamento de dados. Para permitir uma ampla democratização dessa técnica para não especialistas, foram criados dutos mais eficientes e acessíveis. Surpreendentemente, menos de 10 anos após a "revolução da resolução", o crio-EM tornou-se uma técnica essencial para a caracterização de proteínas, tanto na academia quanto na indústria 3,4.
Um dos aspectos mais notáveis da comunidade de pesquisa crio-EM tem sido a disposição de compartilhar abertamente protocolos, estratégias e software5. Essa abertura de tecnologia e experiência contribuiu significativamente para o ritmo muito rápido de desenvolvimento, mas alguns gargalos continuam a impedir que seja totalmente acessível. Nesta coleta de métodos, pretendemos descrever alguns dos desenvolvimentos recentes na preparação de grades adequadas para análise estrutural por crio-EM, que é, juntamente com o acesso ao hardware de análise de dados, o principal gargalo para muitos projetos. Também discutimos novos protocolos que estão atualmente em desenvolvimento neste campo, para novas abordagens em análises crio-EM.
Como dito acima, um dos gargalos atuais para a aplicação rotineira de crio-EM no laboratório é a preparação de amostras. Vários problemas podem ser encontrados no nível de aplicação da amostra nas grades: mais comumente, a orientação preferida da amostra no gelo e sua desnaturação na interface ar-água. Proteger a amostra da interface ar-água é uma solução para esse problema, usando filmes de suporte de carbono ou grafeno que impedem fisicamente que a amostra entre em contato com o ar. Para facilitar a aplicação de filmes finos em grades, de Martin Garrido et al.6 desenvolveram um bloco de flutuação de suporte produzido por uma impressora 3D que permite que pequenas gotas de água e amostra sejam aplicadas de forma controlada. Usando este bloco, as camadas de grafeno e carbono são depositadas de maneira barata e fácil de usar.
Outra maneira de evitar os danos na interface ar-água é limitar o tempo que a proteína fica exposta à atmosfera. Para isso, dois instrumentos diferentes, desenvolvidos por Klebs et al.7 e Budell et al.8, usam novas abordagens para preparação rápida (tão baixa quanto 10 ms) da grade, reduzindo a probabilidade de problemas com a orientação das partículas. Outra vantagem desses dispositivos é a possibilidade de realizar experimentos resolvidos no tempo, uma nova fronteira empolgante para estudos estruturais.
Em uma abordagem contrastante, Nguyen et al.9 relatam um método para congelar grades para análise crio-EM na ausência de dispositivos comerciais ou sob medida, que são muito caros ou difíceis de construir. Eles mostram como grades de qualidade semelhante podem ser obtidas usando um dispositivo caseiro barato que não requer nenhuma instrumentação cara, contribuindo para a democratização do cryo-EM.
Na crio-EM, a amostra de interesse nem sempre é uma proteína, mas pode ser uma pequena molécula ou um grande sistema biológico, como uma célula inteira. A preparação dessas amostras é única e requer etapas específicas, bem como diferentes estratégias na coleta de dados.
Para a difração de elétrons microcristalinos (MicroED), a amostra a ser estudada é um pequeno produto químico que geralmente é encontrado na forma de pó. O pó é aplicado diretamente na grade EM para manter uma forma cristalina. A coleta de dados é então realizada no modo de difração, conforme mostrado por Martynowycz e Gonen10. Em contraste, as células inteiras são muito espessas para a análise crio-EM. Para resolver isso, Bisson et al. relatam um método para usar um MEV para perfurar fisicamente essa amostra, a fim de obter seções delgadas adequadas para estudos estruturais11.
Da amostra à estrutura, é importante manter um registro para cada etapa do processo, pois muitos parâmetros são alterados para cada amostra de proteína, desde a concentração de proteína até as configurações do microscópio e análise de dados. Para isso, Wypych et al.12 desenvolveram uma ferramenta de gerenciamento de informações baseada na web que permite aos usuários organizar seu fluxo de trabalho e acompanhar todos os detalhes necessários para futuras publicações. Isso é particularmente crítico, pois a automação está se tornando cada vez mais prevalente na crio-EM, principalmente nos ambientes da indústria.
O Cryo-EM avançou em um ritmo notável na última década, tanto nas frentes de hardware quanto de software. Para assegurar a divulgação generalizada das melhores práticas e a ampla adoção de novos métodos, é necessário um conjunto transparente de protocolos. Esta edição especial contribuirá para esse esforço.