Method Article

Mapeamento Cerebral Usando um Arranjo de Eletrodos de Grafeno

DOI:

10.3791/64910

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nano-Bioengineering, Incheon National University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um procedimento de mapeamento cerebral baseado em arranjo de grafeno para reduzir a invasividade e melhorar a resolução espaço-temporal. Eletrodos de superfície baseados em arranjo de grafeno exibem biocompatibilidade de longo prazo, flexibilidade mecânica e adequação para mapeamento cerebral em um cérebro complicado. Este protocolo permite a construção simultânea e sequencial de múltiplas formas de mapas sensoriais.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os mapas corticais representam a organização espacial das respostas neurais dependentes da localização a estímulos sensório-motores no córtex cerebral, permitindo a predição de comportamentos fisiologicamente relevantes. Vários métodos, como eletrodos penetrantes, eletroencefalografia, tomografia por emissão de pósitrons, magnetoencefalografia e ressonância magnética funcional, têm sido utilizados para a obtenção de mapas corticais. No entanto, esses métodos são limitados por baixa resolução espaço-temporal, baixa relação sinal-ruído (SNR), altos custos e não biocompatibilidade ou causam danos físicos ao cérebro. Este estudo propõe um método de mapeamento somatossensorial baseado em arranjo de grafeno como uma característica da eletrocorticografia que oferece biocompatibilidade superior, alta resolução espaço-temporal, SNR desejável e dano tecidual minimizado, superando as desvantagens dos métodos anteriores. Este estudo demonstrou a viabilidade de um arranjo de eletrodos de grafeno para mapeamento somatossensorial em ratos. O protocolo apresentado pode ser aplicado não apenas ao córtex somatossensorial, mas também a outros córtices, como o córtex auditivo, visual e motor, fornecendo tecnologia avançada para implementação clínica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um mapa cortical é um conjunto de manchas locais que representam propriedades de resposta a estímulos sensório-motores no córtex cerebral. Eles são uma formação espacial de redes neurais e permitem a previsão para percepção e cognição. Portanto, mapas corticais são úteis na avaliação de respostas neurais a estímulos externos e no processamento de informações sensório-motoras1,2,3,4. Métodos invasivos e não invasivos estão disponíveis para mapeamento cortical. Um dos métodos invasivos mais comuns envolve o uso de eletrodos intracorticais (ou penetrantes) para mapeamento 5,6,7,8.

A avaliação de mapas corticais de alta resolução sob demanda usando eletrodos penetrantes tem enfrentado vários obstáculos. O método é muito trabalhoso para obter um mapa decente e muito invasivo para ser implementado para uso clínico, proibindo o desenvolvimento posterior. Tecnologias mais recentes, como eletroencefalografia (EEG), tomografia por emissão de pósitrons (PET), magnetoencefalografia (MEG) e ressonância magnética funcional (fMRI), têm ganhado popularidade por serem menos invasivas e reprodutíveis. No entanto, devido aos seus custos proibitivos e baixa resolução, são utilizados em um número limitado de casos 9,10,11. Recentemente, eletrodos de superfície flexíveis com confiabilidade de sinal superior têm atraído considerável atenção. Eletrodos de superfície à base de grafeno demonstram biocompatibilidade e flexibilidade mecânica a longo prazo, proporcionando registros estáveis em um cérebro complicado 12,13,14,15,16. Nosso grupo desenvolveu recentemente uma matriz multicanal baseada em grafeno para gravação de alta resolução e neuroestimulação sítio-específica na superfície cortical. Essa tecnologia nos permite acompanhar as representações corticais das informações sensoriais por um longo período.

Este artigo descreve as etapas envolvidas na aquisição de um mapa cerebral do córtex somatossensorial usando um arranjo multieletrodo de grafeno de 30 canais. Para medir a atividade cerebral, um arranjo de eletrodos de grafeno é colocado na área subdural do córtex, enquanto a pata ante, o membro anterior, a pata traseira, o membro posterior, o tronco e os bigodes são estimulados com uma vara de madeira. Os potenciais evocados somatossensoriais (PESs) são registrados para áreas somatossensoriais. Esse protocolo também pode ser aplicado a outras áreas cerebrais, como o córtex auditivo, visual e motor.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos de manejo de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Incheon (INU-ANIM-2017-08).

1. Preparo do animal para a cirurgia

NOTA: Use Sprague Dawley Rat (8-10 semanas de idade) sem o viés sexual para este experimento.

  1. Anestesiar o rato com 90 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de coquetel de xilazina por via intraperitoneal. Para manter a profundidade de anestesia desejada durante toda a cirurgia, fornecer um coquetel suplementar de 45 mg/kg de quetamina e 5 mg/kg de xilazina quando o rato mostrar sinais de despertar.
  2. Confirme se o rato está sob anestesia profunda e verifique regularmente os reflexos do corpo, como pinça dos dedos, pinça da cauda e reflexo corneano.
  3. Faça a barba entre os olhos e a parte de trás das orelhas usando um aparador.
  4. Aplique uma pomada oftálmica nos olhos para evitar que eles sequem.

2. Cirurgia para exposição da superfície cortical

  1. Fixe a cabeça do rato no aparelho estereotáxico com um adaptador estereotáxico. Para manter a temperatura corporal de 37 °C durante a cirurgia, coloque o rato sobre uma almofada de aquecimento com temperatura controlada.
  2. Esterilizar a área raspada com esfoliantes alternados de álcool e iodopovidona três vezes.
  3. Use pinça para segurar firmemente o couro cabeludo e injete 0,1 mL de lidocaína (2%) com uma seringa diretamente no couro cabeludo para induzir anestesia local na área da cirurgia.
  4. Faça uma incisão mediana de 2-3 cm de comprimento com um bisturi e afaste o couro cabeludo para expor o crânio.
  5. Aperte o couro cabeludo com pinças de mosquito para expor o crânio.
  6. Coçar a superfície do crânio com pinça para remover o periósteo.
  7. Blunt dissecar os músculos sobre o crânio occipital para expor a cisterna magna acima do eixo no topo da medula espinhal.
  8. Incise a cisterna magna com a lâmina para drenar o líquido cefalorraquidiano e coloque uma gaze estéril dentro da incisão da cisterna magna para absorver o líquido cefalorraquidiano constantemente para prevenir o edema cerebral e minimizar a inflamação.
  9. Com um lápis, marque no crânio uma janela retangular medindo 3 mm no eixo anteroposterior e 6 mm na direção lateral direita a partir do bregma do hemisfério direito.
    NOTA: A marcação deve fixar uma distância de 1 mm da linha média para evitar a ruptura do seio sagital superior.
  10. Perfure a área marcada de acordo com a coordenada estereotáxica e remova o crânio com um rongeur ósseo.
  11. Para remover a dura-máter, dobre a ponta da agulha de 26 G a 90°, crie um orifício na dura-máter, levante a dura-máter, insira pinças nesse orifício e rasgue-a com pinças.
  12. Coloque gaze molhada com soro fisiológico no córtex somatossensorial para evitar que ele seque.

3. Preparação do arranjo de eletrodos de grafeno conectado ao sistema de gravação

  1. Prepare uma matriz de eletrodos de grafeno com um conector omnético.
    1. Desprenda o arranjo multieletrodo de grafeno sem causar danos aplicando a solução salina.
    2. Remova a cobertura externa dos fios de referência e terra do conector.
  2. Conecte o estágio principal com o conjunto de eletrodos de grafeno ao conector.
  3. Conecte o cabo de interface ligado ao head stage ao sistema de gravação.
  4. Fixe o complexo de arranjo de eletrodos de grafeno no braço estereotáxico.
  5. Para captar sinais neurais de todos os canais, posicione a matriz no córtex somatossensorial sem qualquer flexão, seguindo as coordenadas estereotáxicas predeterminadas.
  6. Coloque um fio de referência sob o tecido atrás do osso occipital e conecte o fio terra à mesa óptica aterrada.

4. Estimulação física e registro de PEE para mapeamento

  1. Abra o software de gravação de sinal neural.
  2. Defina o ambiente do software de gravação: (1) defina a taxa de amostragem para SEPs e filtro de entalhe (60 ou 50 Hz, uma frequência de energia elétrica doméstica) para remover o ruído da linha de energia.
  3. Para o mapeamento do bigode, dobre o bigode com um palito fino.
  4. Cutuque constantemente a pata dianteira, o membro anterior, a pata traseira, o membro posterior e o tronco com um bastão de madeira para mapeamento corporal.
  5. Registrar sinais neurais no sistema de aquisição de dados pelo tempo indicado.

5. Eutanásia animal

  1. Após todos os procedimentos de registro, sacrificar os ratos com anestesia com isoflurano a >5% e realizar dissecção cervical.

6. Medição SEP para mapeamento cortical

  1. Abra o MATLAB de codinome read_Intan_RHS2000_file.m para análise de sinais.
    NOTA: read_Intan_RHS2000_file.m pode ser baixado de "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software".
  2. Clique no botão Executar , selecione o arquivo de gravação com a extensão de nome de arquivo ".rhs" e aguarde até que o arquivo seja processado e lido.
  3. Digite o comando "plot (t, amplifier_data("número do canal",:))" para criar um gráfico de linha 2D dos dados de gravação, encontrar os SEPs e calcular a amplitude dos SEPs em todos os canais.
    NOTA: Digite o número do canal em "número do canal". Por exemplo, "plot(t, amplifier_data(1,:))" cria o gráfico de linhas 2D do canal 1. Além disso, quando o experimentador calcular a amplitude da resposta, escolha a resposta gravada de cada canal.
  4. Obtenha dados colorindo a grade com uma tonalidade diferente de acordo com a amplitude dos SEPs.
    NOTA: O comando "imagesc" do MATLAB ajuda a obter um mapa topográfico mais rapidamente.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve como uma matriz multicanal de grafeno é montada na superfície do cérebro. O mapa somatossensorial foi construído por meio da aquisição de respostas neurais a estímulos físicos e do cálculo da amplitude da resposta. A Figura 1 mostra o esquema desse experimento.

A Figura 2A apresenta as características estruturais de um arranjo de eletrodos de grafeno. Há furos do substrato entre os eletrodos. Esses orifícios aj...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo apresentado fornece um processo detalhado e passo a passo que explica como acessar e mapear as respostas somatossensoriais de ratos usando um arranjo de eletrodos de grafeno. Os dados adquiridos pelo protocolo são SEPs que fornecem informações somatossensoriais que estão sinapticamente ligadas a cada parte do corpo.

Vários aspectos desse protocolo devem ser considerados. Ao extrair o líquido cefalorraquidiano para prevenir o edema cerebral e atenuar a inflamação, é crucial para o e...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não temos nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Universidade Nacional de Incheon (Cooperativa Internacional) para Sunggu Yang.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Seringa de 1mLKOREAVACCINE CORPORATIONinjetando o medicamento para anestesia 
Seringa de 3mLKOREAVACCINE CORPORATIONinjetando o medicamento para anestesia 
Bone rongeurFine Science Tools16220-14remova o conector do crânio
GbrainConecte o eletrodo de grafeno à broca de cabeceira
A ferramentamoe as
brocasosstemmoer o crânio
Graefe íris fórceps ligeiramente curvado serrilhadovubuvudu-02-73010remova o tecido do crânio ou segure o conjunto de
multieletrodos de grafenoGbrainregistra sinais do neurônio
isofluranoHana Pharm Corporationsacrifica o assunto
cetaminayuhan corporationusado para anestesia
lidocaína(2%)Daihan pharmaceutical anestésico local
Matlab R2021bMathworksSoftware de análise de
dados mosquito hemostatosFine Science Tools91309-12prendem a
pomadaAlconevita que o olho seque 
povidonaGreen Pharmaceutical corporationdesinfeta a área de incisão
RHS 32ch Stim/Record headstageintan technologiesM4032conecta o conector ao cabo de interface e contém intan RHS stim/chip amplificador
RHS 6 pés (1,8 m) Cabo de interface Stim SPIintan technologiesM3206conecta eletrodo de grafeno ao
headstage RHS Stim/Software controlador de gravaçãointan technologiesSoftware de aquisição de dados
RHS controlador de estimulação/gravaçãointan technologiesM4200
solução salinaJW Bisturi farmacêutico
HammacherHSB 805-03
instrumento estereotáxicoestoelting prendero assunto
estéril AgulhahipodérmicaKOREAVACCINE CORPORATIONremova a dura-máter
Steven Iris Tissue ForcepsKASCO50-2026dura-máter
no.11FEATHERinscise os
sicssors cirúrgicosFine Science Tools14090-09inscise o couro cabeludo e remova a estimulação do
bigodevara
xilazinaBayer Coréiausada para anestesia
FALCON do crânio Implante de do limpador do couro cabeludo remova a lâmina cirúrgica da do couro cabeludo da de madeira da dura-máter

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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