Artigo de método

Isolamento e Análise do Transcriptoma de Tipos Celulares Vegetais

DOI:

10.3791/64913

⸱

7 de abril de 2023

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

Neste artigo

Resumo

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A viabilidade e a eficácia de métodos scRNA-seq de alto rendimento anunciam uma era de célula única na pesquisa de plantas. Apresentamos aqui um procedimento robusto e completo para o isolamento de tipos específicos de células de raízes de Arabidopsis thaliana e posterior construção e análise da biblioteca de transcriptomas.

Resumo

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Em organismos multicelulares, a programação do desenvolvimento e as respostas ambientais podem ser altamente divergentes em diferentes tipos celulares ou mesmo dentro das células, o que é conhecido como heterogeneidade celular. Nos últimos anos, o isolamento de célula única e do tipo celular combinado com técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) tornaram-se ferramentas importantes para o estudo de processos biológicos em resolução de célula única. No entanto, o isolamento de células vegetais é relativamente mais difícil devido à presença de paredes celulares vegetais, o que limita a aplicação de abordagens unicelulares em plantas. Este protocolo descreve um procedimento robusto para o isolamento de células únicas e do tipo celular com células vegetais baseado em classificação celular ativada por fluorescência (FACS), que é adequado para análise multi-ômica a jusante e outros estudos. Usando linhas de marcadores fluorescentes de raízes de Arabidopsis , demonstramos como tipos celulares particulares, tais como células do periciclo xilema-pólo, células iniciais da raiz lateral, células da calota lateral da raiz, células do córtex e células endodérmicas, são isolados. Além disso, um método eficaz de análise do transcriptoma a jusante usando Smart-seq2 também é fornecido. O método de isolamento celular e as técnicas de análise do transcriptoma podem ser adaptados a outros tipos celulares e espécies vegetais e têm amplo potencial de aplicação na ciência vegetal.

Introdução

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As células são a unidade fundamental de todos os organismos vivos e desempenham funções estruturais e fisiológicas. Embora as células em organismos multicelulares mostrem aparente sincronicidade, células de diferentes tipos e células individuais apresentam diferenças em seus transcriptomas durante o desenvolvimento e respostas ambientais. O sequenciamento de RNA de célula única de alto rendimento (scRNA-seq) fornece um poder sem precedentes para a compreensão da heterogeneidade celular. A aplicação de scRNA-seq em ciências vegetais tem contribuído para o sucesso na construção de um atlas celular vegetal1, tem sido usado para identificar táxons ....

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Protocolo

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O seguinte protocolo foi otimizado para sementes de A. thaliana wild-type (WT) sem fluorescência e linhagens fluorescentes para os seguintes tipos de células radiculares: células do periciclo xilema-pólo (J0121), células iniciais da raiz lateral, células da calota lateral (J3411), células da endoderme e do córtex (J0571) (Figura 1A). Todas as linhagens de marcadores foram obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais), exceto a linha de marcador de célula de iniciação de raiz lateral, que foi gerada pela introdução de uma construção GFP orientada por promotor GATA23 em uma planta de Arabidopsis....

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Resultados

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Isolamento de protoplastos
Este protocolo é eficaz para a classificação de protoplastos de linhagens fluorescentes de marcadores radiculares de A. thaliana. Essas linhagens de marcadores foram desenvolvidas pela fusão de proteínas fluorescentes com genes expressos especificamente em tipos celulares alvo, ou usando linhagens de armadilhas intensificadoras (Figura 1). Numerosos tecidos e órgãos foram dissecados em tipos celulares expressando marcadores fluorescente.......

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Discussão

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O protocolo baseado em Smart-seq2 pode gerar bibliotecas de sequenciamento confiáveis a partir de várias centenas de células8. A qualidade do material de partida é essencial para a precisão da análise do transcriptoma. O FACS é uma ferramenta poderosa para o preparo de células de interesse, mas este procedimento, especialmente a etapa de protoplast, deve ser otimizado para aplicações em plantas. Microdissecção por captura a laser (LCM) ou células dissecadas manualmente também podem ser usadas como.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Estabelecemos este protocolo na instalação multi-ômica de célula única da Escola de Agricultura e Biologia, Shanghai Jiao Tong University, e fomos apoiados pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 32070608), pelo Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) e pela Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ m peneiraSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Analisador de fragmentos AgilentAglientAglient 5200
Kit de DNA de alta sensibilidadeAgilent AglientDNF-474-0500
Ampure XP contasBECKMANA63881
BetaínayuanyeS18046-100g
BleachMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) alvejante
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Celulase R10Yakult (Japão)9012-54-8
Celulase RSYakult (Japão)9012-54-8
Tubo de centrífuga (1,5 mL)Eppendolf30121589
DNase, RNase, DNA e RNA Afastado Descontaminantes de SuperfícieBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0,1 M)< br / > invitrogen18090050
EtanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodiaBD-65745
FACSSonySH800S
Ponta de filtro  (1000 µ L)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Ponta do filtro  (200 µ L)Thermo ScientificTF140-200-Q
Ponta do filtro (10 µ L)Thermo ScientificTF104-10-Q
Ponta do filtro (100 µ L)Thermo ScientificTF113-100-Q
Microscópio fluorescenteNikonEclipse Ni-E
Misturador rotativo quadridimensionalKylin -BellBE-1100
Hemicelulasesigma9025-56-3
IS PCR primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix( 2X)Roche 
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Japão)9032-75-1
Suporte de separação magnéticainvitrogen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl2 Centrífuga
EppendorfCentrífuga Titan
Timi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA Kit de Preparação PrimerilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'PCR
instrumento TermocicladorA24811
PectolyaseYakult (Japão)9033-35-6
Linhas de marcadores de plantasNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 fluorômetroinvitrogenQ32866
inibidor de RNase Thermo ScientificEO0382
de 10977023água sem RNase
A400 mM manitol, 0,05% BSA, 20 mM MES (pH5,7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solução B1 % (p/v)celulase R10, 1 % (p/v) celulase RS, 1 %  (p/v)hemicelulase, 0,5 %  (w/v)pectolyase e 1 %  (w / v) Macerozyme R10 em uma alíquota fresca de solução A
Pilão estérilBIOTREAT453463
Coador (40 µ m )Sorfa 251100
SuperScript IV transcriptase reversa (200 U/µ L)tampão invitrogen18090050
SuperScript IV (5x)invitrogen18090050
Tubo de ensaio (5 mL)BD Falcon352052
Tubos de PCR de paredes finas com tampas (0,5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'Vortex
TitanVM-T2
7958935001Solução de

Referências

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  1. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
  2. Denyer, T., et al.

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