Quantificando o estresse de replicação em células de câncer de ovário usando imunofluorescência de DNA de fita simples

Resumo

Aqui, descrevemos um método baseado em imunofluorescência para quantificar os níveis de DNA de fita simples nas células. Este método eficiente e reprodutível pode ser utilizado para examinar o estresse de replicação, uma característica comum em vários tipos de câncer de ovário. Além disso, este ensaio é compatível com um pipeline de análise automatizado, o que aumenta ainda mais a sua eficiência.

Resumo

O estresse de replicação é uma característica de vários cânceres de ovário. O estresse de replicação pode emergir de várias fontes, incluindo quebras de fita dupla, conflitos de transcrição-replicação ou oncogenes amplificados, resultando inevitavelmente na geração de DNA de fita simples (ssDNA). A quantificação do ssDNA, portanto, apresenta uma oportunidade para avaliar o nível de estresse de replicação em diferentes tipos de células e sob várias condições ou tratamentos prejudiciais ao DNA. Evidências emergentes também sugerem que o ssDNA pode ser um preditor de respostas a drogas quimioterápicas que visam o reparo do DNA. Aqui, descrevemos uma metodologia detalhada baseada em imunofluorescência para quantificar o ssDNA. Esta metodologia envolve a marcação do genoma com um análogo da timidina, seguido pela detecção baseada em anticorpos do análogo na cromatina em condições não desnaturantes. Alongamentos de ssDNA podem ser visualizados como focos sob um microscópio de fluorescência. O número e a intensidade dos focos co-relacionam-se diretamente com o nível de ssDNA presente no núcleo. Também descrevemos um pipeline automatizado para quantificar o sinal de ssDNA. O método é rápido e reprodutível. Além disso, a simplicidade dessa metodologia a torna passível de aplicações de alto rendimento, como telas genéticas e de medicamentos.

Introdução

O DNA genômico é frequentemente exposto a múltiplos ataques de várias fontes endógenas e exógenas¹. A frequência de dano endógeno correlaciona-se diretamente com os níveis de subprodutos metabólicos, como espécies reativas de oxigênio ou aldeídos, que são intrinsecamente maiores em vários tipos de câncer, incluindo o câncer de ovário ^2,3. É imperativo que os danos ao ADN sejam eficazmente resolvidos; caso contrário, pode promover lesões genotóxicas e, consequentemente, mutagênese. A capacidade das células de reparar lesões genotóxicas depende da funcionalidade das vias de reparo do DNA ....

Protocolo

NOTA: A linhagem celular de câncer de ovário, OVCAR3, foi usada nessas etapas, mas este protocolo é amplamente aplicável a várias outras linhagens celulares, incluindo aquelas derivadas de fontes não ovarianas. Um esquema do protocolo é mostrado na Figura 2.

1. Planear as células

1. Faça tampas revestidas com poli-L-lisina.
   1. Adicione as coberturas autoclavadas de 12 mm de diâmetro a um tubo cônico de 50 mL com solução de poli-L-lisina e coloque em um balancim por 15 min.
   2. Aspirar a solução em um capuz de cultura de tecidos. Lave as tampas adicionando água estéril e coloqu....

Resultados

Imagens representativas e a quantificação de focos de IdU dos núcleos derivados das células não tratadas e células tratadas com hidroxiureia 0,5 mM por 24 h são mostradas na Figura 4. Ambos os núcleos são corados e identificáveis no canal DAPI. A análise dessas imagens consiste em quantificar o número de focos em cada núcleo. O número de focos é proporcional ao grau de estresse de replicação.

Discussão

Como foi mencionado no protocolo, é valioso incluir alguns controles experimentais para garantir que o ensaio esteja funcionando. Estes incluem uma amostra sem tratamento com IdU, bem como uma amostra sem tratamento com anticorpos primários. Ambos os controles negativos devem produzir células que são coradas por DAPI, mas não contêm sinal de IdU.

Com base nas condições experimentais e linhagens celulares utilizadas, diferentes diluições de anticorpos podem ser necessárias para obter o melhor s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3% de paraformaldeído (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g de sacarose + 100 mL 10X PBS + água para fazer o volume de 925 mL. Adicione 75 mL de PFA livre de metanol a 40%, misture e faça alíquotas de 50 mL antes do armazenamento Armazenamento: Armazene em -20 > C
5-iodo-2'-desoxiuridina (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Para estoque de 10 mM: dissolver 3,541 mg de IdU em 1 mL de amônia líquida 1 N Armazenamento: Armazenado em -20 ° Anticorpo
anti-BrdU C	BD Biosciences	347580	Armazenamento: Armazenar em 4 ° C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 anticorpo secundário	Thermo Scientific	A32766	Sensível à luz - mantenha no escuro Armazenamento: Armazenar em 4 ° C
Albumina de Soro Bovino (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Feito adicionando massa específica ao volume de PBS Armazenamento: Armazenar em 4 ° C
Tampa de Vidro Circular	Microscopia Eletrônica Sciences	72230-01
Software NIS GA3	Nikon
OVCAR3	ATCC	HTB-161 Meios de	Crescimento: RPMI suplementado com L-glutamina, 0,01 mg/mL de insulina bovina; soro fetal bovino até uma concentração final de 20% e 1X Pen Strep Armazenamento: Meios de Congelamento: meios de crescimento + 5% de DMSO e armazenados em -80 ° C
Solução de Poli-L-Lisina	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Armazenamento: Armazenar em 4 ° C
ProLong Diamond Antifade Mountant com DAPI	Thermo Scientific	P36962	Armazenamento: Armazene em 4 ° C
Tripsina-EDTA, 0,25%	Genesee Scientific	25-510	Armazenamento: Armazenar em 4 ° C
Água, filtrada estéril	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Armazenamento: Armazenar em 4 ° O

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