Artigo de método

Geração e Manutenção de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Primatas Derivadas da Urina

DOI:

10.3791/64922

⸱

28 de julho de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve um método para isolar, expandir e reprogramar células derivadas da urina de primatas humanos e não humanos para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), bem como instruções para a manutenção livre de alimentadores das iPSCs recém-geradas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abordagens entre espécies que estudam células-tronco pluripotentes de primatas e seus derivados são cruciais para entender melhor os mecanismos moleculares e celulares de doenças, desenvolvimento e evolução. Para tornar as células-tronco pluripotentes induzidas por primatas (iPSCs) mais acessíveis, este artigo apresenta um método não invasivo para gerar iPSCs de primatas humanos e não humanos a partir de células derivadas da urina, e sua manutenção usando um método de cultura livre de alimentadores.

A urina pode ser coletada de um ambiente não estéril (por exemplo, a gaiola do animal) e tratada com um coquetel antibiótico de amplo espectro durante a cultura de células primárias para reduzir a contaminação de forma eficiente. Após a propagação das células derivadas da urina, as iPSCs são geradas por um método de transdução modificado de um sistema vetorial do vírus Sendai comercialmente disponível. As primeiras colônias de iPSC podem já estar visíveis após 5 dias, e podem ser colhidas após 10 dias, no mínimo. A passagem de rotina de aglomerados com tampão de dissociação livre de enzimas suporta a pluripotência das iPSCs geradas por mais de 50 passagens.

Introdução

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Comparações genômicas de primatas humanos e não humanos (NHPs) são cruciais para entender nossa história evolutiva e a evolução de características específicas do ser humano1. Além disso, essas comparações permitem inferir a função identificando sequências conservadas de DNA2, por exemplo, para priorizar variantes associadas à doença3. Comparações de fenótipos moleculares, como níveis de expressão gênica, são cruciais para melhor interpretar comparações genômicas e descobrir, por exemplo, diferenças fenotípicas celulares. Além disso, eles têm - semelhante a comparações no nível do DNA - o potencial de inferir relevância funcional e, portanto, interpretar melhor a variação clinicamente relevante em humanos4. A incorporação de dados fenotípicos moleculares abrangentes nesses estudos comparativos requer recursos biológicos apropriados (isto é, células ortológicas entre espécies). No entanto, razões éticas e práticas dificultam ou impossibilitam o acesso a essas células comparáveis, especialmente durante o desenvolvimento. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) permitem a geração desses tipos celulares inacessíveis in vitro5,6, são experimentalmente acessíveis e têm sido utilizadas para comparações de primatas 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Para gerar iPSCs, é preciso adquirir as células primárias a serem reprogramadas. As células isoladas da urina têm a vantagem de poderem ser amostradas de primatas de forma não invasiva e de poderem ser prontamente reprogramadas, provavelmente devido ao seu perfil molecular semelhante ao das células-tronco15. As condições de cultura para manter as iPSCs de primatas são tão importantes quanto a reprogramação; classicamente, a cultura de células-tronco pluripotentes humanas requer um meio não definido, baseado em soro, e co-cultura de fibroblastos embrionários de camundongos - as chamadas células alimentadoras - que fornecem nutrientes essenciais e um arcabouço para células-tronco embrionárias (CTEs)16. Desde o desenvolvimento de sistemas de cultura quimicamente definidos e livres de alimentadores17,18, existem atualmente várias opções de meios e matrizes de cultura iPSC comercialmente disponíveis. No entanto, a maioria dessas condições de cultura foi otimizada para CTEs e iPSCs humanas e, portanto, pode funcionar menos bem na cultura iPSC NHP. Neste protocolo de vídeo, fornecemos instruções para gerar e manter iPSCs humanas e NHP derivadas de cultura de células urinárias.

Desde o primeiro relato de geração de iPSC pela expressão forçada de fatores definidos em fibroblastos, em 2006, esse método tem sido aplicado a diversos tipos celulares de diversas origens19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32º. Entre elas, apenas células derivadas da urina podem ser obtidas de forma completamente não invasiva. Com base no protocolo previamente descrito por Zhou et al.33, pode-se isolar e expandir células da urina de primatas mesmo de amostras não estéreis, suplementando antibióticos de amplo espectro15. Notavelmente, as células derivadas da urina amostradas por este protocolo exibem um alto potencial para produzir iPSCs, dentro de um período de tempo mais curto (colônias tornam-se visíveis em 5-15 dias) do que a reprogramação convencional de fibroblastos (20-30 dias, em nossa experiência), e com uma taxa de sucesso suficientemente alta. Essas células derivadas da urina foram classificadas como a população mista de células-tronco mesenquimais e células epiteliais da bexiga, causando a alta eficiência da reprogramação15.

Além da variação nas células primárias, os métodos de reprogramação para gerar iPSCs também variam de acordo com a finalidade de uso. Os procedimentos convencionais de reprogramação de células somáticas humanas foram realizados pela superexpressão de fatores de reprogramação com vetores de retrovírus ou lentivírus, o que permitiu a integração do DNA exógeno no genoma 5,34,35. Para manter as iPSCs geradas genomicamente intactas, os pesquisadores desenvolveram uma ampla variedade de sistemas de não-integração - vetor PiggyBac excisável36,37, vetor epissomal38,39, vetores virais não integradores como o vírus Sendai 40 e adenovírus 41, transfecção de RNAm42, transfecção de proteínas 43,44 e tratamento de compostos químicos 45. Devido à eficiência e facilidade no manuseio, os vetores de reprogramação baseados no vírus de Sendai são utilizados neste protocolo. A infecção de células primárias é realizada em uma cultura de suspensão de 1 h de células e vírus em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 antes do plaqueamento. Essa etapa modificada poderia aumentar a probabilidade de contato entre superfícies celulares e vírus, em comparação com o método convencional, no qual os vírus são adicionados diretamente à cultura de células aderentes e, assim, produzir mais colônias de iPSC15.

A passagem de células-tronco pluripotentes humanas e NHP pode ser feita por passagem de aglomeração e passagem de célula única. O ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) é um agente quelante de baixo custo que se liga aos íons cálcio e magnésio e, assim, impede a atividade aderente da caderina e da integrina. O EDTA também é usado como um reagente de dissociação leve e seletivo, pois as células indiferenciadas se desprendem antes das células diferenciadas devido às suas diferentes moléculas de adesão. A dissociação completa induz a morte celular maciça de iPSCs de primatas através da hiperativação da miosina mediada pela proteína quinase (Rho/Rock) associada à bobina Rho/Rho. Portanto, a suplementação do meio de cultura com um inibidor de Rho/Rock é essencial para experimentos que necessitem de células isoladas em suspensão46,47. Neste protocolo, recomendamos a passagem de aglomeração como o método de passagem de rotina e recomendamos a passagem de célula única apenas quando for necessário, por exemplo, quando a semeadura de números de células definidos for necessária, ou durante a subclonagem.

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Protocolo

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Este procedimento experimental foi aprovado pelo comitê de ética responsável pela experimentação humana (20-122, Ethikkommission LMU München). Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes.
NOTA: A aprovação deve ser obtida do comitê de ética apropriado antes de iniciar experimentos com amostras humanas e de NHP. Todos os procedimentos experimentais devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Cada uma das etapas a seguir deve ser realizada usando técnica estéril em um gabinete de segurança biológica. Todas as composições de buffer e mídia podem ser encontradas na Tabela Suplementar S1. Certifique-se de que todos os meios são aquecidos à temperatura ambiente (22 °C) antes de serem adicionados às células. Cada etapa de centrifugação deve ser realizada à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

1. Isolamento de células de amostras de urina

CUIDADO: Garantir que os doadores humanos estejam livres do vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV) e vírus da hepatite C (HCV). Para NHPs, certifique-se de que os possíveis doadores/células estejam livres de patógenos específicos - Vírus B (BV), Vírus da Imunodeficiência Símia (SIV), Betaretrovírus Símio (SRV) e Vírus Linfotrópico de Células T Simianas (STLV).

  1. Prepare uma placa de 12 poços revestida com gelatina adicionando 500 μL de gelatina a 0,2% por poço e distribua o líquido movendo a placa. Colocar a 37 °C durante, pelo menos, 30 minutos antes do necessário.
  2. Coletar amostras de urina humana em tubos cônicos de 50 mL. Para primatas, colete urina do chão do biotério com uma seringa.
    NOTA: Um volume de 5 mL de urina mostrou-se suficiente para isolar pelo menos uma colônia em 42% das tentativas. No entanto, o uso de um volume maior de ~50 mL de urina é recomendado para aumentar a chance de isolar colônias. A urina do NHP deve ser colhida o mais fresco possível, de preferência imediatamente após a micção. O armazenamento de amostras de urina a 4 °C por 4 h não teve efeito negativo sobre a taxa de sucesso do protocolo, mas tempos de armazenamento mais longos não foram testados.
  3. Centrifugar o tubo contendo urina a 400 × g por 10 min e aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 1 mL no tubo.
  4. Ressuspender o pellet no 1 mL residual de líquido. Agrupar as suspensões em um tubo se vários tubos de urina foram coletados.
  5. Lavar as células adicionando 10 ml de tampão de lavagem da urina (ver Tabela Suplementar S1) contendo 2,5 μg/ml de anfotericina ao tubo e misturar cuidadosamente a suspensão utilizando uma pipeta serológica.
  6. Centrifugar o tubo a 200 × g por 10 min e aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente <0,2 mL no tubo.
  7. Ressuspender o pellet de células em 1 mL de meio de urina primária (ver Tabela Suplementar S1) contendo 0,5 μg/mL de anfotericina por 50 mL de urina inicialmente processada (ressuspender em 1 mL, mesmo que menos de 50 mL de urina tenha sido processada).
  8. Aspirar a gelatina dos poços (preparada na etapa 1.1) e a placa 1 mL da suspensão da etapa 1.7 em um poço de uma placa de 12 poços. Repita para quantos poços desejar, ou para quantos mililitros de suspensão disponíveis.
    Opcional: Para evitar contaminação proveniente da coleta insalubre de amostras, adicionar 100 μg/mL de reagente antimicrobiano às células a partir de então, até a primeira passagem.
  9. Coloque a placa numa incubadora a 37 °C, 5% CO2 .
  10. Adicionar 1 mL de meio urinário primário por poço diariamente até o dia 5, sem remover o meio existente.
  11. No dia 5, aspirar 4 mL de meio da placa, deixando aproximadamente 1 mL de meio. Adicionar 1 ml de meio REMC (ver Tabela Suplementar S1) por poço para obter uma mistura 1:1 com o novo meio de cultura.
  12. Substitua metade do meio por meio REMC todos os dias até que as primeiras colônias apareçam (Figura 1A, B). Portanto, remova 1 mL de meio velho e adicione 1 mL de meio REMC fresco por poço.

2. Expansão das células urinárias

NOTA: A passagem celular urinária deve ser realizada antes que a cultura atinja 90% de confluência.

  1. Preparar a quantidade desejada de placas de 12 poços revestidas com gelatina, conforme indicado na etapa 1.1.
  2. Aspirar o meio velho e lavar as células adicionando 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  3. Aspirar a DPBS e adicionar 300 μL de enzima de dissociação 0,5x diluída com DPBS. Incubar a placa a 37 °C durante 5 min.
  4. Adicionar 700 μL de meio REMC para interromper a reação enzimática. Pipetar suavemente a suspensão usando uma pipeta P1000 até que as células sejam dissociadas em células únicas.
  5. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e centrifugar o tubo a 200 × g por 5 min.
  6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de meio REMC.
  7. Conte as células usando um contador de células (um hemocitômetro ou um contador de células automatizado).
  8. Para expansão das células urinárias, placa 1,5 × 10 4 a 3 × 104 células em 1 mL de meio REMC em uma placa de 12 poços revestida com gelatina a 0,2%.
  9. Realizar trocas de meio subsequentes a cada dois dias até que a cultura atinja 80%-90% de confluência. Portanto, aspirar o meio velho e adicionar 1 mL de meio REMC fresco.

3. Geração de iPSCs pela infecção vetorial do vírus Sendai

NOTA: Para obter o fluxo de trabalho do procedimento de reprogramação, consulte a Figura 2A. As células urinárias usadas para reprogramação devem ser tão jovens quanto possível, mas uma perda notável da eficiência da reprogramação não é observada antes da passagem 4. O Kit de Reprogramação de Vírus de Sendai deve ser usado em uma instalação BL-2. Manusear vírus sob uma cabine de segurança biológica com fluxo laminar e usar sempre equipamentos de segurança apropriados para evitar a exposição da mucosa.

  1. Prepare uma placa de 12 poços revestida com matriz de membrana basal adicionando 500 μL de matriz de membrana basal por poço e distribua o líquido movendo a placa. Incubar a placa a 37 °C por pelo menos 1 h e substituir a matriz da membrana basal por 900 μL de meio REMC. Conservar o prato a 37 °C até à utilização.
  2. Descongele rapidamente os componentes do Kit de Reprogramação de Sendai em banho-maria a 37 °C. Misture os vírus de Sendai (policistrônicos KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC e KLF4) com um MOI de 5 e adicione o meio REMC até 100 μL. Use a equação (1):
    Calculando a fórmula do volume do vírus, método MOI, equação para aplicações do estudo da pilha.
    NOTA: Como os títulos de vírus diferem entre os lotes, sempre verifique o título no certificado de análise fornecido pelo fabricante.
    Opcional: Use a proteína fluorescente verde (GFP) vírus de Sendai como um controle positivo para a eficiência da transdução. Para isso, prepare mais 3,5 × 104 células num tubo separado durante o passo 3.3.
  3. Para dissociação das células urinárias, siga os passos 2.2-2.4. Conte as células usando o contador de células e transfira 7 × 104 células urinárias para um tubo de 1,5 mL.
  4. Centrifugar o tubo a 200 × g durante 5 minutos e remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Ressuspender o pellet em 100 μL da mistura de SeV preparada na etapa 3.2. Incubar o tubo durante 1 h a 37 °C para infecção da suspensão.
  5. Colocar a suspensão sobre as placas de 12 poços revestidas com matriz de membrana basal que foram preparadas na etapa 3.1. Rotineiramente, as placas 1 × 10 4 e 2,5 × 104 células por poço em duplicatas.
  6. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2. Substitua o meio por 1 mL de meio REMC fresco 24 h após a transdução e no dia 3.
  7. No dia 5 após a transdução, troque o meio para o meio gerador de PSC (ver Tabela Suplementar S1), com trocas subsequentes de meio a cada dois dias. Portanto, remova o meio antigo e adicione 1 mL de meio de geração de PSC por poço.
    NOTA: Pode levar até 15 dias até que as primeiras colônias apareçam.
  8. Escolha colônias iPSC individuais quando o tamanho da colônia exceder 1 mm. Para fazer isso, raspe e colete cuidadosamente uma única colônia com uma pipeta p10 sob um microscópio. Transferir a colônia para um novo poço de uma placa de 12 poços revestida com uma matriz de membrana basal contendo 750 μL de meio de cultura PSC.
    Opcional: Enxaguar a placa com DPBS e tratar por 1 min com EDTA 0,5 mM antes da colheita pode apoiar a cultura robusta de etapas posteriores. Se as células forem cultivadas por mais tempo para esperar por colônias emergentes posteriores, não execute esta etapa de tratamento com EDTA.
  9. Cultivar as células a 37 °C e 5% de CO2 com subsequentes trocas de meio em dias alternados, conforme indicado na secção 4 do protocolo. Quando a colônia colhida atingir um diâmetro de 2 mm, continuar com a passagem rotineira da iPSC, conforme explicado na seção 5 do protocolo.

4. Mudança média

NOTA: O meio de cultura deve ser trocado a cada dois dias até que as colônias cresçam suficientemente grandes para a passagem.

  1. Aspirar o meio velho e adicionar 750 μL do meio fresco por placa de 12 poços. Para mudar para um tipo diferente de meio, substitua o meio pelo menos 1 dia após a passagem.

5. Passagem

NOTA: As células devem ser passadas quando as colônias iPSC crescem o suficiente (diâmetro > 2 mm), ou as colônias estão prestes a tocar umas às outras. Rotineiramente, as iPSCs podem ser divididas aproximadamente a cada 5 dias. Use clump-passaging (etapa 5.1) para manutenção de rotina e passaging de célula única (etapa 5.2) para experimentos em que um número definido de células é necessário. Caso as iPSCs se diferenciem muito, a colheita de colônias (etapa 5.3) pode ajudar a melhorar a pureza das culturas.

  1. Passagem de aglomeração
    1. Prepare uma placa de 12 poços revestida com matriz de membrana basal adicionando 500 μL de matriz de membrana basal por poço e distribua o líquido movendo a placa. Incubar a placa a 37 °C durante, pelo menos, 1 h. Substitua a matriz da membrana basal por 500 μL de meio de cultura PSC e armazene a placa a 37 °C até o uso.
    2. Aspirar o meio das células cultivadas e lavar as células adicionando cuidadosamente 500 μL de DPBS. Remova o DPBS e adicione 500 μL de EDTA 0,5 mM ao poço.
    3. Incubar a placa em TR por 2-5 min, até que as colônias comecem a se desprender. Observe cuidadosamente as células sob o microscópio.
    4. Quando as bordas das colônias começarem a descascar e as lacunas entre as células se tornarem visíveis (Figura 3A), remova o EDTA e adicione cuidadosamente 500 μL de DPBS.
      OBS: Sempre pipetar contra a parede lateral do poço e nunca diretamente sobre as células, para não desprender as células da placa.
    5. Aspirar o DPBS e lavar o poço com 500 μL de meio de cultura PSC usando uma pipeta p1000. Pipetar para cima e para baixo 1x-5x para dispersar as colônias em aglomerados de tamanho apropriado (Figura 3A). Não pipetar muito.
      NOTA: Se as iPSCs forem acidentalmente pipetadas demais, adicione 10 μM do inibidor de rocha Y-27632 ao meio. Isso pode aumentar a sobrevida, já que as iPSCs não são capazes de sobreviver como células únicas.
    6. Transferir 1/10-1/50 da suspensão de aglomeração celular para os novos poços. A razão depende da confluência do poço antes da divisão, da densidade desejada das células semeadas e da preferência clonal iPSC.
    7. Distribua as touceiras uniformemente no poço, movendo suavemente a placa para frente e para trás várias vezes. Incubar a placa durante pelo menos 30 minutos a 37 °C para deixar os grumos fixarem.
    8. Substituir o meio por 750 μL de meio de cultura PSC se forem observadas muitas células mortas flutuantes; caso contrário, adicionar 250 μL de meio de cultura PSC. Colocar a placa a 37 °C e 5% CO2 numa incubadora.
      NOTA: A substituição do meio após 30 minutos é crítica, especialmente para linhagens celulares instáveis (por exemplo, NHPs).
    9. Troque o meio a cada 2-3 dias até que as colônias cresçam o suficiente para a passagem. Para mudança média, siga a etapa 4 do protocolo.
  2. Passagem de célula única
    1. Preparar a placa de cultura revestida com matriz de membrana basal, conforme indicado na etapa 5.1.1, com a adição de 10 μM Y-27632 ao meio de cultura PSC.
      Opcional: Adicionar 10 μM Y-27632 às células 1-3 h antes da passagem para aumentar a sobrevivência de linhagens celulares sensíveis.
    2. Aspirar o meio e lavar as células adicionando 500 μL de DPBS. Remova o DPBS e adicione 300 μL de solução de descolamento aos poços.
    3. Incubar a placa a 37 °C durante 5-10 min. Quando for observado desprendimento suficiente das células ao microscópio, adicionar 700 μL de meio de cultura PSC ou DPBS.
    4. Pipetar para cima e para baixo 5-10x usando uma pipeta p1000 até que as células sejam dissociadas em células únicas. Não pipetar muito, a fim de evitar danos celulares.
    5. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL contendo pelo menos 2 mL de DPBS para diluir a solução de descolamento.
    6. Centrifugar o tubo a 200 × g durante 5 min e aspirar completamente a solução, sem perturbar o pellet celular.
    7. Ressuspender o pellet em 500 μL de meio de cultura PSC suplementado com 10 μM Y-27632.
    8. Contar as células e sementes 5.000-7.000 células por placa de 12 poços revestida com matriz de membrana basal, preparada na etapa 5.2.1.
      Observação : se um número de célula diferente for necessário, altere para um poço maior ou menor de acordo.
    9. Incubar a placa durante pelo menos 30 minutos a 37 °C e 5% de CO2 para deixar as células fixadas.
    10. Substitua o meio por 750 μL de meio de cultura PSC + 10 μM Y-27632 se forem observadas muitas células mortas; caso contrário, adicionar 250 μL + 10 μM Y-27632.
      NOTA: Esta etapa é crítica, especialmente para as linhagens celulares instáveis (por exemplo, NHPs).
    11. Colocar a placa a 37 °C e 5% CO2 numa incubadora.
    12. Trocar o meio para meio de cultura PSC sem Y-27632 1 a 2 dias após a bivisão, para permitir que as células voltem a exibir a morfologia clássica da colônia (Figura 3B).
    13. Troque o meio a cada 2 dias até que as colônias cresçam o suficiente. Para mudança média, siga a seção 4 do protocolo.
  3. Passagem de iPSCs por colheita de colônias
    1. Preparar 12 poços revestidos com matriz de membrana basal, conforme indicado na etapa 5.1.1.
    2. Aspirar o meio e lavar as células adicionando cuidadosamente 500 μL de DPBS. Remova o DPBS e adicione 500 μL de EDTA 0,5 mM ao poço.
    3. Incubar a placa em RT por 1-3 min e observar as células ao microscópio, até que o descolamento da colônia seja visível nas bordas.
    4. Retire o EDTA e adicione cuidadosamente 500 μL de DPBS. Aspirar o líquido antes de adicionar lentamente 500 μL de meio de cultura PSC ao poço, sem desprender as células.
    5. Use uma pipeta p200 para escolher a colônia desejada ao microscópio, sem coletar as células diferenciadas. Para fazer isso, coce suavemente sobre a colônia enquanto ocupa o meio que contém células.
    6. Transfira cada colônia colhida para um poço revestido com matriz de membrana basal, conforme preparado na etapa 5.3.1. Dissociar as células em pequenos aglomerados usando uma pipeta p1000, pipetando as células 2-5x.
    7. Incubar a placa durante 30 min a 37 °C e 5% de CO2, permitindo a fixação dos grumos.
    8. Substituir o meio por 750 μL de meio de cultura PSC se forem observadas muitas células mortas flutuantes; caso contrário, adicionar 250 μL de meio de cultura PSC.
      NOTA: A substituição do meio após 30 minutos é crítica, especialmente para as linhagens celulares instáveis (por exemplo, NHPs).
    9. Colocar a placa a 37 °C e 5% CO2 numa incubadora.
    10. Troque o meio a cada 2-3 dias até que as colônias cresçam o suficiente para a passagem. Para fazer isso, siga a seção 4 do protocolo.

6. Congelamento de células urinárias e iPSCs para armazenamento a longo prazo

NOTA: Rotineiramente, as iPSCs são congeladas como aglomerados em meio de congelamento celular sem contagem. A pipetagem deve ser mínima, para evitar a dissociação em células únicas. Para células urinárias, rotineiramente, 1,5 × 10 4 a 3 × 104 células são congeladas por tubo, permitindo que o usuário descongele um tubo diretamente em um poço de uma placa de 12 poços sem a necessidade de outra etapa de contagem.

  1. Preparar 5 mL de DPBS em um tubo de 15 mL.
  2. Para o congelamento das células urinárias, siga os passos 2.2-2.4 do protocolo. Para o congelamento de iPSCs, siga as etapas 5.1.2-5.1.5 do protocolo de passagem de aglomeração.
  3. Transferir a suspensão para o tubo de 15 ml preparado no passo 6.1. Para o congelamento das células urinárias, conte 10 μL da suspensão celular usando um hemocitômetro. Centrifugar as células por 5 min a 200 × g e aspirar completamente o sobrenadante.
  4. Ressuspender o pellet celular em 400 μL de meio de congelamento celular por tubo e distribuir as células até a quantidade desejada de criotubos.
  5. Transfira os criotubos imediatamente para -80 °C. Transfira os tubos congelados para um congelador de -150 °C ou nitrogênio líquido 1 dia após o congelamento a -80 °C para armazenamento a longo prazo.

7. Descongelamento de células urinárias e iPSCs

  1. Para o descongelamento das células urinárias, preparar a quantidade desejada de 12 poços revestidos com gelatina, conforme indicado na etapa 1.1 do protocolo. Para iPSCs, preparar as placas de 12 poços revestidas com matriz de membrana basal, conforme indicado na etapa 5.1.1. Em ambos os casos, não troque a matriz por meio.
  2. Preparar um tubo de 15 ml contendo 4 ml de DPBS e armazená-lo a 37 °C.
  3. Coloque rapidamente um frasco congelado de células num banho-maria a 37 °C para descongelar, até que um pedaço de gelo flutuante se torne visível.
    OBS: Limpe o criotubo com etanol antes e depois da incubação em banho-maria para evitar contaminações.
  4. Adicionar 500 μL de meio REMC para células urinárias ou 500 μL de meio de cultura PSC para iPSCs à suspensão contendo gelo e transferir imediatamente a suspensão para o tubo de 15 mL pré-aquecido preparado na etapa 7.2.
  5. Centrifugar o tubo a 200 × g durante 5 minutos e eliminar completamente o sobrenadante.
  6. Para as células urinárias, ressuspender o pellet em 1 mL de meio REMC. Para iPSCs, ressuspender cuidadosamente o pellet em 750 μL de meio de cultura PSC. Evite pipetar demais, a fim de manter as touceiras intactas.
    Opcional: A suplementação do meio com 10 μM Y-27632 pode apoiar a sobrevivência de iPSCs após o descongelamento.
  7. Aspirar a matriz das placas de 12 poços preparadas na etapa 7.1 e transferir cuidadosamente a suspensão da célula para o poço.
  8. Coloque a placa durante a noite a 37 °C e 5% CO2 em uma incubadora.
  9. No dia seguinte, substituir o meio por meio de cultura PSC, sem Y-27632 para iPSCs e com REMC para células urinárias.
  10. Cultivar as células a 37 °C e 5% CO2 em incubadora.
  11. Troque o meio a cada 2-3 dias até que as células cresçam o suficiente para a passagem. Para mudança média, siga a seção 4 do protocolo.

8. Imunocitoquímica

NOTA: A imunomarcação com anticorpos visando marcadores relacionados à pluripotência, como NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 e EpCAM é uma das validações mais amplamente utilizadas de iPSCs recém-geradas. Mais informações sobre os anticorpos e diluições podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

  1. Placas iPSCs 1-3 dias antes do uso em um número apropriado de placas de 12 poços. Aspirar o meio, lavar as células adicionando 500 μL de DPBS e remover o DPBS. Adicionar 400 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% por poço e fixar as células por 15 min na RT.
  2. Retire o PFA a 4% e lave as células 3x com DPBS. Adicionar 400 μL de tampão de bloqueio por poço e incubar a placa por 30 min no TR.
  3. Aspirar o tampão de bloqueio e adicionar os anticorpos diluídos em 400 μL de tampão de diluição de anticorpos (ADB) a cada poço. Incubar a placa a 4 °C durante a noite.
  4. Remova o ADB que contém os anticorpos primários e lave as células 3x com DPBS.
  5. Aspirar a DPBS e adicionar 400 μL de anticorpos secundários diluídos em ADB por poço. Incubar a placa por 1 h no TR no escuro.
  6. Remova o ADB e lave as células 3x com DPBS. Adicionar 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluído em DPBS por poço e incubar por 3 min no TR.
  7. Aspirar a solução DAPI e lavar a célula 3x com DPBS. Adicionar 500 μL de DPBS para aquisição de imagens.

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Resultados

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Ao isolar células da urina humana e do NHP, diferentes tipos de células podem ser identificados diretamente após o isolamento. As células escamosas, bem como várias células redondas menores, são excretadas com a urina; a urina feminina contém muito mais células escamosas do que a masculina (Figura 1B - Dia 0; Figura Suplementar S1). Após 5 dias de cultura em meio de urina primária, observam-se as primeiras células aderentes em proliferação (Figura 1A,B

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Discussão

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As iPSCs são tipos celulares valiosos, pois permitem a geração de tipos celulares inacessíveis in vitro. Como os materiais de partida para a reprogramação, por exemplo, fibroblastos não estão facilmente disponíveis em todas as espécies de primatas, este trabalho apresenta um protocolo para a geração de iPSCs a partir de células derivadas da urina. Essas células podem ser obtidas de forma não invasiva, mesmo a partir de amostras não estéreis de urina de primatas, suplementando-se o meio de cultura com antibiótico...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela DFG EN 1093/5-1 (projeto número 458247426). M.O. foi apoiado pela JSPS Overseas Research Fellowship. Todas as figuras foram criadas com BioRender.com. A citometria de fluxo foi realizada com o auxílio da citometria de fluxo do Core Facility no Biomedical Center Munich. Gostaríamos de agradecer a Makoto Shida e Tomoyo Muto da ASHBi, Universidade de Kyoto, pelo apoio à videografia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Accumax™ solução de desprendimento celular (Solução de desprendimento)Sigma-AldrichSCR006
Anfotericina B-SolutionMerckA2941-100ML
Anticorpo de Camundongo Anti-Humano TRA-1-60 Stem Cell Technologies60064Diluição: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugado Anticorpo Miltenyi Biotec130-122-965Diluição: 1/50
Bambanker™ (Meio de congelamento celular)Nippon GeneticsBB01
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Placa de cultura de células multipoços, 12 poços CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Condessa™ II contador de células automatizadoThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® Tubos de 1,5 mL com Código de Barras 2D (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Diferentes tipos de Cryotubes podem ser usados para congelamento. Os tubos de código de barras 2D têm a vantagem de que as informações da amostra podem ser armazenadas em um banco de dados com informações exclusivas do tubo.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Kit de Reprogramação (Sendai virus reprogramming kit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-fenilindol dicloridratoSigma-Aldrich10236276001
DMEM High GlicoseTH. GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutaminaFisher Scientific15373541
Anticorpo Secundário Anti-Rato Anti-Rato Anti-Rato (H+L) Altamente Adsorvido Cruzado, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Diluição: 1/500
Anticorpo Secundário Anti-Coelho IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorvido para Burro, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207Diluição: 1/500
DPBS sem Cálcio sem MagnésioTH. GeyerL0615-500
EpCAM Anticorpo Policlonal Recombinante para Coelho (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Diluição: 1/500
Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL de fundo cônicoGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL de fundo cônicoGreiner BIO-ONE227261
Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado pelo calor, Brasil (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 
Gelatina de pele suínaSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™ Matriz de Membrana de Pouso de Fator de Crescimento Reduzido Livre de LDEV, Qualificado por ESCThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ SuplementoThermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ 240i Incubadora de CO2Fisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe gabinete de segurançaKendro51017905
Human EGF, grau premiumMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FijiVersão 2.9.0
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Tubo de Microcentrifugação PP, 1,5 mLNerbe Plus04-212-1000
Microscópio Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Mouse anticorpo anti-alfa-fetoproteínaR& D SystemsMAB1368Diluição: 1/100
de anticorpo de actina de músculo liso de camundongoR & D SystemsMAB1420Diluição: 1/100
de anticorpo de tubulina anti-beta-III de camundongoR & D SystemsMAB1195Diluição: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb Tecnologia de Sinalização Celular4903SDiluição: 1/400
Normoclue™ (Reagente antimicrobiano)Anticorpo de Coelho Invivogenant-noc
Oct-4 Tecnologia de Sinalização Celular2750SDiluição: 1/400
Paraformaldeído (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122A mistura de Penicilina-Estreptomicina contém 100 U/mL de Penicilina e 100 µ g/ml de estreptomicina.
Recombinante Human FGF-basicPeproTech100-18B
Recombinante Human PDGF-AB
SIGMA 4-16KS
Célula Epitelial Renal Basal MediumATCCPCS-400-030
Kit de Crescimento de Células Epiteliais RenaisATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900Tecnologia de Sinalização Celular4900SDiluição: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAbNEB4755SDiluição: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00A produção deste meio foi descontinuada, use StemFit Basic04CT para linhagens de células humanas ou StemFit Basic03 para primatas não humanos.
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Triplo™ Selecione Enzima (1x), sem vermelho de fenol (Enzima de dissociação)Thermo Fisher Scientific12563011
Waterbath Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, Sal de dicloridrato (Inibidor de rocha)BiozolBYT-ORB153635
TampãoPara composição, consulte o suplemento tabela S1
TampãoPara composição, consulte a tabela suplementar S1
MeioPara composição, consulte a tabela suplementar S1
MeioPara composição, consulte a tabela suplementar S1
cultura PSCPara composição, consulte a tabela suplementar S1
Meio de geração PSCPara composição, consulte a tabela suplementar S1
Tampãode urina Para composição, consulte a tabela suplementar S1
663441, Centrífuga de bancada refrigerada PeproTech 100-00AB de diluição de anticorpos de bloqueio REMC primário de urina Meio de para lavagem

Referências

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