O presente protocolo descreve um método para isolar, expandir e reprogramar células derivadas da urina de primatas humanos e não humanos para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), bem como instruções para a manutenção livre de alimentadores das iPSCs recém-geradas.
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Artigo de método
Geração e Manutenção de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Primatas Derivadas da Urina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Abordagens entre espécies que estudam células-tronco pluripotentes de primatas e seus derivados são cruciais para entender melhor os mecanismos moleculares e celulares de doenças, desenvolvimento e evolução. Para tornar as células-tronco pluripotentes induzidas por primatas (iPSCs) mais acessíveis, este artigo apresenta um método não invasivo para gerar iPSCs de primatas humanos e não humanos a partir de células derivadas da urina, e sua manutenção usando um método de cultura livre de alimentadores.
A urina pode ser coletada de um ambiente não estéril (por exemplo, a gaiola do animal) e tratada com um coquetel antibiótico de amplo espectro durante a cultura de células primárias para reduzir a contaminação de forma eficiente. Após a propagação das células derivadas da urina, as iPSCs são geradas por um método de transdução modificado de um sistema vetorial do vírus Sendai comercialmente disponível. As primeiras colônias de iPSC podem já estar visíveis após 5 dias, e podem ser colhidas após 10 dias, no mínimo. A passagem de rotina de aglomerados com tampão de dissociação livre de enzimas suporta a pluripotência das iPSCs geradas por mais de 50 passagens.
Introdução
Comparações genômicas de primatas humanos e não humanos (NHPs) são cruciais para entender nossa história evolutiva e a evolução de características específicas do ser humano1. Além disso, essas comparações permitem inferir a função identificando sequências conservadas de DNA2, por exemplo, para priorizar variantes associadas à doença3. Comparações de fenótipos moleculares, como níveis de expressão gênica, são cruciais para melhor interpretar comparações genômicas e descobrir, por exemplo, diferenças fenotípicas celulares. Além disso, eles têm - semelhante a comparações no nível do DNA - o potencial....
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Protocolo
Este procedimento experimental foi aprovado pelo comitê de ética responsável pela experimentação humana (20-122, Ethikkommission LMU München). Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes.
NOTA: A aprovação deve ser obtida do comitê de ética apropriado antes de iniciar experimentos com amostras humanas e de NHP. Todos os procedimentos experimentais devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Cada uma das etapas a seguir deve ser realizada usando técnica estéril em um gabinete de segurança biológica. Todas as composições de buffer e mídia podem ser encontradas na Tabela Supl....
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Resultados
Ao isolar células da urina humana e do NHP, diferentes tipos de células podem ser identificados diretamente após o isolamento. As células escamosas, bem como várias células redondas menores, são excretadas com a urina; a urina feminina contém muito mais células escamosas do que a masculina (Figura 1B - Dia 0; Figura Suplementar S1). Após 5 dias de cultura em meio de urina primária, observam-se as primeiras células aderentes em proliferação (Figura 1A,B
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Discussão
As iPSCs são tipos celulares valiosos, pois permitem a geração de tipos celulares inacessíveis in vitro. Como os materiais de partida para a reprogramação, por exemplo, fibroblastos não estão facilmente disponíveis em todas as espécies de primatas, este trabalho apresenta um protocolo para a geração de iPSCs a partir de células derivadas da urina. Essas células podem ser obtidas de forma não invasiva, mesmo a partir de amostras não estéreis de urina de primatas, suplementando-se o meio de cultura com antibiótico.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela DFG EN 1093/5-1 (projeto número 458247426). M.O. foi apoiado pela JSPS Overseas Research Fellowship. Todas as figuras foram criadas com BioRender.com. A citometria de fluxo foi realizada com o auxílio da citometria de fluxo do Core Facility no Biomedical Center Munich. Gostaríamos de agradecer a Makoto Shida e Tomoyo Muto da ASHBi, Universidade de Kyoto, pelo apoio à videografia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Accumax™ solução de desprendimento celular (Solução de desprendimento) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Anfotericina B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anticorpo de Camundongo Anti-Humano TRA-1-60 | Stem Cell Technologies | 60064 | Diluição: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugado Anticorpo | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Diluição: 1/50 |
| Bambanker™ (Meio de congelamento celular) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Placa de cultura de células multipoços, 12 poços CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Condessa™ II contador de células automatizado | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® Tubos de 1,5 mL com Código de Barras 2D (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Diferentes tipos de Cryotubes podem ser usados para congelamento. Os tubos de código de barras 2D têm a vantagem de que as informações da amostra podem ser armazenadas em um banco de dados com informações exclusivas do tubo. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Kit de Reprogramação (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-fenilindol dicloridrato | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glicose | TH. Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamina | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Anticorpo Secundário Anti-Rato Anti-Rato Anti-Rato (H+L) Altamente Adsorvido Cruzado, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Diluição: 1/500 |
| Anticorpo Secundário Anti-Coelho IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorvido para Burro, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Diluição: 1/500 |
| DPBS sem Cálcio sem Magnésio | TH. Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Anticorpo Policlonal Recombinante para Coelho (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Diluição: 1/500 |
| Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL de fundo cônico | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL de fundo cônico | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado pelo calor, Brasil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | ||
| Gelatina de pele suína | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ Matriz de Membrana de Pouso de Fator de Crescimento Reduzido Livre de LDEV, Qualificado por ESC | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Suplemento | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i Incubadora de CO2 | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe gabinete de segurança | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, grau premium | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Versão 2.9.0 | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Tubo de Microcentrifugação PP, 1,5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscópio Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anticorpo anti-alfa-fetoproteína | R& D Systems | MAB1368 | Diluição: 1/100 |
| de anticorpo de actina de músculo liso de camundongo | R & D Systems | MAB1420 | Diluição: 1/100 |
| de anticorpo de tubulina anti-beta-III de camundongo | R & D Systems | MAB1195 | Diluição: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Tecnologia de Sinalização Celular | 4903S | Diluição: 1/400 |
| Normoclue™ (Reagente antimicrobiano) | Anticorpo de Coelho Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 | Tecnologia de Sinalização Celular | 2750S | Diluição: 1/400 |
| Paraformaldeído (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | A mistura de Penicilina-Estreptomicina contém 100 U/mL de Penicilina e 100 µ g/ml de estreptomicina. |
| Recombinante Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinante Human PDGF-AB | |||
| SIGMA | 4-16KS | ||
| Célula Epitelial Renal Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Kit de Crescimento de Células Epiteliais Renais | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Tecnologia de Sinalização Celular | 4900S | Diluição: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Diluição: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | A produção deste meio foi descontinuada, use StemFit Basic04CT para linhagens de células humanas ou StemFit Basic03 para primatas não humanos. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Triplo™ Selecione Enzima (1x), sem vermelho de fenol (Enzima de dissociação) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Sal de dicloridrato (Inibidor de rocha) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Tampão | Para composição, consulte o suplemento tabela S1 | ||
| Tampão | Para composição, consulte a tabela suplementar S1 | ||
| Meio | Para composição, consulte a tabela suplementar S1 | ||
| Meio | Para composição, consulte a tabela suplementar S1 | ||
| cultura PSC | Para composição, consulte a tabela suplementar S1 | ||
| Meio de geração PSC | Para composição, consulte a tabela suplementar S1 | ||
| Tampão | de urina Para composição, consulte a tabela suplementar S1 |
Referências
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al.
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Reimpressões e permissões
