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Artigo de método

Isolamento e purificação de β-glucanas fúngicas como estratégia de imunoterapia para glioblastoma

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DOI:

10.3791/64924

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2 de junho de 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Pharmacy, Universidad de Sevilla, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla, Hospital Universitario Virgen del Rocío, CSIC, Universidad de Sevilla

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve as etapas de purificação e estudos subsequentes de quatro diferentes β-glucanos fúngicos como potenciais moléculas imunomoduladoras que aumentam as propriedades antitumorais da micróglia contra células de glioblastoma.

Resumo

Um dos maiores desafios no desenvolvimento de terapias eficazes contra o glioblastoma é superar a forte supressão imunológica dentro do microambiente tumoral. A imunoterapia tem emergido como uma estratégia eficaz para transformar a resposta do sistema imune contra as células tumorais. Macrófagos e micróglias associados à glioma (MAGs) são os principais impulsionadores desses cenários anti-inflamatórios. Portanto, aumentar a resposta anticancerosa em MAGs pode representar uma terapia coadjuvante potencial para tratar pacientes com glioblastoma. Nessa linha, as moléculas fúngicas de β-glucano têm sido conhecidas há muito tempo como potentes moduladores imunológicos. Sua capacidade de estimular a atividade imune inata e melhorar a resposta ao tratamento tem sido descrita. Essas características moduladoras são parcialmente atribuídas à sua capacidade de se ligar a receptores de reconhecimento de padrões, que, curiosamente, são muito expressos em GAMs. Assim, este trabalho está focado no isolamento, purificação e subsequente uso de β-glucanas fúngicas para aumentar a resposta tumoricida da microglia contra células de glioblastoma. As linhagens celulares de glioblastoma de camundongo (GL261) e microglia (BV-2) são usadas para testar as propriedades imunomoduladoras de quatro diferentes β-glucanas fúngicas extraídas de cogumelos fortemente utilizados na indústria biofarmacêutica atual: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum. Para testar esses compostos, ensaios de co-estimulação foram realizados para medir o efeito de um meio pré-ativado condicionado por microglia sobre a proliferação e ativação da apoptose em células de glioblastoma.

Introdução

Apesar do advento de novas conquistas no campo da neuro-oncologia, a expectativa de vida dos pacientes com glioblastoma permanece escassa. As terapias padrão-ouro contra tumores cerebrais são baseadas na fusão de cirurgia, radioterapia e quimioterapia. No entanto, na última década, a imunoterapia emergiu como uma poderosa estratégia para o tratamento de diferentes tipos decâncer1. Assim, a possibilidade de aproveitar a resposta imune do organismo contra as células tumorais tornou-se recentemente o quarto pilar da oncologia.

Há muito se sabe que um dos maiores desafios na área é superar a forte imunossupressão encontrada no microambientetumoral2. Particularmente, no caso do glioblastoma, uma das formas mais comuns e agressivas de câncer cerebral, desvendar caminhos-chave que orquestram tais cenários pró-tumorais e encontrar novos compostos que poderiam neutralizar a resposta depressiva do sistema imunológico pode abrir caminho para futuras terapias contra essa doença incurável.

O cérebro possui suas próprias células do sistema imunológico, e o tipo de célula mais relevante são a microglia. Comprovadamente, essas células têm um comportamento bastante complexo em diferentes doençascentrais3. No caso de tumores cerebrais primários (por exemplo, glioblastoma), essas células são deslocadas para um fenótipo anti-inflamatório que suporta as células tumorais para colonizar o parênquima cerebral3. Inúmeras publicações têm reforçado o papel importante dessas células durante a progressão tumoral. Uma das principais razões para isso é que a micróglia associada ao glioma e os macrófagos infiltrados (MAGs) respondem por um terço da massa tumoral total, sugerindo a influência inequívoca de seus estados de ativação durante a progressão do tumor cerebral 4,5.

Nesse sentido, os β-glucanos fúngicos têm sido descritos como moléculas potentes que desencadeiam respostas imunes efetivas, incluindo fagocitose e produção de fatores pró-inflamatórios, levando à eliminação de agentes perniciosos 6,7,8,9,10. Os β-glucanos fúngicos têm sido geralmente estudados usando extratos de diferentes partes do cogumelo. Entretanto, a atribuição de efeitos específicos requer sua purificação para evitar ambiguidades e poder compreender o mecanismo de ação de tais moléculas como agentes imunomoduladores8.

Neste trabalho, β-glucanas solúveis são purificadas do corpo frutífero de quatro diferentes cogumelos, regularmente empregados como cogumelos comestíveis (Pleurotus ostreatus e Pleurotus djamor) e medicinais (Ganoderma lucidum e Hericium erinaceus). Em particular, estes quatro cogumelos têm uma grande utilização na indústria alimentar e farmacêutica e foram produzidos no âmbito de uma economia circular ecológica numa empresa comercial (ver Tabela de Materiais).

A fim de estabelecer as bases para o uso futuro de β-glucanas fúngicas em terapias de câncer cerebral, estratégias de purificação bem definidas e estudos pré-clínicos que se aprofundam em sua interação putativa com células do sistema imunológico são essenciais para avaliar seu papel potencial como mediadores antitumorais. Este trabalho descreve as inúmeras etapas de isolamento e purificação necessárias para recuperar os β-glucanos solúveis contidos nos corpos frutíferos do cogumelo selecionado. Uma vez purificadas com sucesso, as células da microglia são ativadas para melhorar seu fenótipo inflamatório. Células de glioblastoma de camundongo (GL261) são revestidas com um meio diferente condicionado por microglia, previamente tratado com esses extratos, e então seu efeito sobre o comportamento das células tumorais é avaliado. Curiosamente, estudos piloto de nosso laboratório (dados não mostrados) descobriram como a microglia pró-inflamatória pode retardar a migração de células tumorais e as propriedades de invasão não apenas em células de glioblastoma, mas também em outras linhagens de células cancerosas. Este trabalho multidisciplinar pode fornecer uma ferramenta útil para pesquisadores de oncologia testarem compostos promissores capazes de aumentar a resposta imune em muitos tipos diferentes de tumores.

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Protocolo

As quatro diferentes variantes de cogumelos descritas neste protocolo foram obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Isolamento de β-glucanas fúngicas

  1. Extração e isolamento de polissacarídeos solúveis de cogumelos
    OBS: Polissacarídeos solúveis de cogumelos (SMPs) foram obtidos de acordo com o procedimento esquematicamente mostrado na Figura 1.
    1. Enxaguar suavemente os corpos frutíferos frescos de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum (cerca de 2.000 g/cogumelo) em água destilada cinco vezes.
    2. Secar os corpos frutíferos a 50 ± 2 °C numa estufa convencional de secagem ao ar até atingir um peso constante (~24 h).
    3. Moer os cogumelos secos em um moinho de lâminas, obtendo cerca de 200 g de pó de cada cogumelo.
    4. Suspender 100 g de pó de cogumelo (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum) em 1.000 mL de H2Od. Em seguida, autoclave a 121 °C por 15 min e, finalmente, deixar em temperatura ambiente por 30 min.
    5. Centrifugar a suspensão resultante a 6.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    6. Secar o precipitado contendo polissacarídeos insolúveis de cogumelos (PIM) a 50 ± 2 °C numa estufa de secagem ao ar durante 24 horas.
    7. Descarte o precipitado e mantenha o sobrenadante. Concentrar o sobrenadante 10 vezes em um evaporador rotativo.
    8. Precipitar o concentrado contendo SMPs com etanol (concentração final de 80%) a 4 °C durante a noite.
    9. Centrifugar a suspensão de etanol a 6.000 x g por 15 min a 4 °C, reter o pellet (precipitado) e descartar o sobrenadante com uma pipeta.
    10. Lavar o precipitado três vezes com etanol a 80% antes de dissolvê-lo em H2Od (10% p/v). Ajustar o pH para 6,5/7 e a temperatura para 37 °C e tratar com 2 u e 4 U de α-amilase e glucoamilase, respectivamente, para solubilizar α-glucanas seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    11. Após o tratamento com α-amilase/glucoamilase, ajustar o pH e a temperatura para 8,0 e 50 °C, respectivamente, e tratar com alcalase (2,5 U/g de proteína) (ver Tabela de Materiais) para solubilizar as proteínas.
      NOTA: Este tratamento enzimático sequencial remove a maioria dos α-glucanos e proteínas que co-precipitam com β-glucanos na precipitação de etanol.
    12. Após hidrólise, centrifugar o hidrolisado a 6.000 x g por 15 min a 4 °C e o sobrenadante limpo concentrado cinco vezes em evaporador rotativo. Precipitar novamente com etanol 80%.
    13. Solubilizar o precipitado resultante em H2Od e dialisar em água destilada por 24 h usando membranas de tubos de celulose (membranas de corte de 12.000 Da; ver Tabela de Materiais) para remover moléculas de baixo peso molecular. Recuperar a porção solúvel em água e liofilizá-la para produzir β-glucanas solúveis (SβGs).
  2. Medição de açúcar e proteína
    1. Medir o teor de açúcares totais de cada fração pelo método fenol-ácido sulfúrico, utilizando glicose como padrão8.
      NOTA: A quantificação do teor de β-glucana também pode ser feita usando o kit de ensaio de β-glucana (cogumelo e levedura; ver Tabela de Materiais), com base na hidrólise enzimática e na atividade das oxidorredutases: exo-1,3-β-glucanase, glicose oxidase, β-glucosidase e peroxidase, com a subsequente formação da quinoneimina. Siga as instruções do fabricante, com pequenas modificações.
    2. Use 18 MH 2 SO4 em vez de 12 MH2SO4.
    3. Avaliar o teor de glucanas totais e α-glucanas separadamente.
    4. Meça os valores de β-glucano resultantes como a diferença entre os valores totais de glucano e α-glucano (triplicata) seguindo o protocolo de Kjeldahl. Em certos casos, o teor de proteína pode ser determinado pelo método de Lowry, utilizando-se a albumina para traçar a curva de calibração11,12.
  3. Análise por espectroscopia de absorção no ultravioleta
    1. Obter os espectros ultravioleta (UV) de SβG usando um espectrofotômetro UV-visível (ver Tabela de Materiais) escaneando as amostras na região de 200-400 nm (Figura 2).
    2. Preparar 1,0 mg/mL de cada SβG em H2Od, transferir a solução para uma cubeta de quartzo e escanear à temperatura ambiente.
  4. Análise da distribuição de peso molecular
    1. Estimar a homoegeneidade de SβGs e a massa molecular de polímeros por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (ver Tabela de Materiais) equipado com um detector de índice de refração e uma coluna de filtração linear em gel ultra-hidrogel (300 mm x 7,8 mm; Gráfico 3).
    2. Realizar o ensaio a 40 °C usando água deionizada como eluente a uma vazão de 0,5 mL/min-1 e dextrans (110, 80 e 50 kDa) como padrões (ver Tabela de Materiais). Coletar uma fração de 5 mL.
  5. Análise de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
    1. Registre os espectros no infravermelho (Figura 4) em um espectrômetro FTIR na faixa de 4000-500 cm-1. As amostras devem ser previamente misturadas com KBr para formar filmes (procedimento FTIR padrão; consulte as instruções do fabricante e Tabela de Materiais).
  6. Análise da composição molecular
    1. Estimar as composições moleculares de SβGs por cromatografia em camada delgada de alta eficiência (HPTLC) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS), seguindo procedimentos padrão12.

2. Estudo in vitro da estimulação da microglia induzida por β-glucanos

  1. Cultura celular de células de glioblastoma e microglia de camundongos em lâminas de câmara de 8 poços
    NOTA: Este protocolo é específico para linhagens celulares GL261 (glioblastoma) e BV2 (microglia). No entanto, com pequenas modificações, essas etapas poderiam potencialmente ser usadas para estudar outras linhagens de células cancerígenas e imunes.
    1. Preparar meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) modificado com L-glutamina, 4,5 g/L D-glicose e sem piruvato. Adicionar 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Pré-aqueça o material em banho-maria a 37 °C por 15 min.
    2. Descongelar alíquotas BV2 e GL261 congeladas em banho-maria (37 °C) por 2 min e, pouco antes de descongelar completamente, transportá-las para uma capela de fluxo laminar e plaquear as células em dois frascos T25 estéreis diferentes (um para cada linhagem celular).
    3. Incubar os frascos T25 a 37 °C, 5% CO2 até que a cultura seja confluente.
      NOTA: Dependendo das condições de congelamento e do tempo de criopreservação, o tempo até a confluência pode variar. Essas linhagens celulares geralmente necessitam entre 3 a 5 dias para atingir a confluência em um frasco T75.
    4. Depois que a cultura de células BV2 se tornar confluente, transfira-a para lâminas de câmara de 8 poços 0,6 x 106 células/poço. Mantenha as corrediças da câmara de 8 poços na incubadora por 24 horas.
    5. Uma vez que as células da microglia são plaqueadas nas lâminas da câmara de 8 poços, repita o mesmo protocolo com as células GL261.
  2. Ativação da microglia com β-glucanas
    1. Revestir as células BV2 com quatro diferentes β-glucanas (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus) na concentração de 0,2 mg/mL por 72 h. Uma condição experimental deve permanecer sem tratamento (meio normal), atuando como grupo controle.
    2. Recolher o sobrenadante com uma pipeta após 72 h e passar o volume restante através de um filtro de seringa de 0,20 μm. Em seguida, congelar o sobrenadante a -80 °C por pelo menos 24 h.
  3. Tratamento do GL261 com meio pré-ativado condicionado por microglia
    1. Uma vez que o GL261 esteja 80% confluente dentro das lâminas da câmara de 8 poços, adicionar meio microglial tratado com β-glucano (passo 2.2.2) a uma concentração de volume final de 25% por 72 h (volume total: 250 μl/poço).
    2. Retire o meio após 72 h de incubação e descarte-o.
    3. Lavar as células com tampão fosfato salino (PBS; pH 7,4, 0,1 M) três vezes por 5 minutos.
    4. Fixar as células adicionando 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 °C durante 15 minutos.
      NOTA: Dependendo dos diferentes anticorpos que podem ser usados para imunofluorescência, os métodos de fixação podem diferir dos PFA típicos de 4%. Os fixadores à base de álcool podem ser mais eficientes na preservação de certos epítopos.
  4. Estudo de imunofluorescência
    1. Lavar as amostras com PBS com triton X (PBST; 0,01%) por 10 min três vezes.
    2. Retirar o PBST e adicionar tampão de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 10% em PBST (Tabela 1) por 30 min à temperatura ambiente.
    3. Remover o tampão de bloqueio e adicionar 200 μL por poço de PBS contendo a mistura de anticorpos primários (1:500 anticorpo monoclonal Ki-67 de rato e 1:500 anticorpo caspase-3 clivado de coelho; ver Tabela de Materiais). Incubar durante a noite a 4 °C.
    4. Após 24 h de incubação a 4 °C, deixar as amostras à temperatura ambiente durante 30 min.
    5. Lave os poços três vezes por 10 min com PBS em um agitador (baixa velocidade).
    6. Remova o PBS e substitua por 200 μL por poço de PBS contendo a mistura de anticorpos secundários (1:200 anti-rato anti-rato IgG (H + L) anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 488 e 1:200 burro anti-coelho IgG (H + L) anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 647; ver Tabela de Materiais) por 45 min à temperatura ambiente no escuro.
    7. Lave as amostras com PBS por 10 min em um agitador multiuso.
    8. Retirar o PBS e adicionar 200 μL por poço de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluído em PBS (1:5.000) por 1 min.
    9. Remova o DAPI (ver Tabela de materiais) e lave as células por 5 minutos em PBS.
    10. Retire a estrutura do poço e adicione 50 μL de PBS:glicerol (1:1) em cada poço e cubra com uma lamínula.
    11. Sele as lâminas com esmalte.
    12. Adquira imagens a 20x usando um sistema de microscópio confocal (ver Tabela de materiais).

3. Quantificação e análise da proliferação celular tumoral e apoptose

NOTA: Para medir o efeito potencial dos diferentes β-glucanos sobre a proliferação celular tumoral e apoptose, um script in house foi utilizado no software ImageJ para quantificar o número de pixels positivos de Ki67 (proliferação) e cCasp3 (apoptose)13.

  1. Abra o ImageJ. Clique no botão Plugins . Clique em Coloc2, um plugin previamente instalado na pasta do plugin, e finalmente selecione a imagem para analisar11.
    NOTA: Este plugin foi disponibilizado após contato anterior com o Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Em vez do script, tanto o software ImageJ quanto o Fiji têm ferramentas diferentes para análise de colocalização (veja Tabela de materiais), com propriedades semelhantes.
  2. Defina limiares de acordo com as condições de controle (não tratadas, somente DMEM). Clique no botão OK .
    NOTA: Para evitar discrepâncias de fundo e intensidade, todas as imagens devem ser tiradas nas mesmas condições. Preferencialmente, as sessões de imagem devem ser realizadas no mesmo dia, e os parâmetros microscópicos inalterados entre as imagens.
  3. Certifique-se de que as imagens resultantes dos pixels colocalizados e uma janela de resumo que forneça a porcentagem ou o número bruto de pixels acima do limite sejam exibidas. Normalizar os resultados com relação às condições de controle (não tratadas).
    NOTA: Todos os dados são dados como média ± MEV. A análise estatística foi realizada por meio de gráficos e softwares de análise (ver Tabela de Materiais). Utilizou-se ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Tukey. Os erros são representados como erro padrão da média (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).

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Resultados

Purificação bem sucedida de β-glucanas
A massa de MP, SMPs e SβGs obtida dos corpos frutíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus após o processo de extração e purificação está resumida na Tabela 1. A composição básica (carboidratos totais, β-glucanos e proteínas) de MP, SMPs e SβGs obtidos dos fungos está representada na Tabela 2. Esses resultados mostram como o protocolo permitiu a recuperação de uma grande quan...

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Discussão

Este trabalho descreve o uso de técnicas bem estabelecidas para isolar, purificar e caracterizar com sucesso o conteúdo de SβGs de quatro fungos diferentes. Os resultados mostraram como após a extração em água quente das SMPs, obtidas de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus, seguida de tratamento hidrolítico com α-amilase, glucosidase e protease, os teores de α-glucana e proteína foram reduzidos, enriquecendo significativamente a quantidade de SβGs puros.

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Divulgações

Não há interesses concorrentes a declarar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer à Dra. Vasiliki Economopoulos por seu script interno para medir o sinal de fuluorescência no ImageJ. Gostaríamos também de agradecer ao CITIUS (Universidade de Sevilha) e a todo o seu pessoal pelo apoio durante a manifestação. Este trabalho foi apoiado pelo espanhol FEDER I + D + i-USE, US-1264152 da Universidade de Sevilha, e pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Corrediças de câmara de 8 poçosThermo Fisher, EUA171080
Forno de secagem a arJ.P. Selecta S.A., Espanha2000210
AlbuminaSigma-Aldrich, St. LouisA7030
AlcalaseNovozymes, Dinamarcaprotease
Alexa Fluor 488Thermofisher, EUAA32731
Alexa Fluor 647Thermofisher, EUAA32728
Moinho de lâminasRetsch, Alemanha  SM100
Albumina de soro bovinoMERK, AlemanhaA9418
Membrana de tubo de celuloseSigma-Aldrich, St. LouisD9402
CentrífugaMERK, AlemanhaEppendorf, 5810R
Pluggins de colocalizaçãoImageJ(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPIMERK, Alemanha28718-90-3
DextransPharmacosmos, Holbalk, DinamarcaDextran 410, 80, 50
Dulbecco´ s modificado Eagle&agudo; s medium, Gluta MAXTMGibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA10564011
Extenda (α- Amilase/Glucoamilase)Novozymes, Dinamarca
Soro fetal bovinoGibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUAA4736301
Espectrómetro FT-IRBruker-Vertex, SuíçaVERTEX 70v
Softwarede representação gráfica e análiseGraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
Sistema H2SO4
HPLCWaters Corp, Milford, MA, EUAIncubadora de HPLC
EppedorfGalaxy 170S
Q Exactive GC, Thermo Scientific725500
ParaformaldeídoMERK, AlemanhaP6148
Penicilina/estreptomicinaSigma-Aldrich, St. LouisP4458
medidor de pHCrison, Barcelona, EspanhaBasic 20
Solução salina tamponada com fosfatoGibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA1010-015
Anticorpo Caspase-3 clivado em coelho (Asp175)Abcam, Reino Unidoab243998
Rato Ki-67 MonoclonalThermofisher, USAMA5-14520
Evaporador rotativoBü chi Ibé rica S.L.U., EspanhaEl Rotavapor R-100
Coluna linear de filtração em gel ultra-hidrogel (300 mm x 7,8 mm)Waters Corp, Milford, MA, EUAWAT011545
Espectrofotômetro UV-VisívelAmersham Bioscience, Reino UnidoUltrospec 2100 pro
VectaMountVector Laboratories, C.A, EUAH-5000-60
Banho-mariaJ.P. Selecta S.A., Espanha
Sistema de microscópio confocal Zeiss LSM 7 DUO.Zeiss, Alemanha
β-glucano Kit de EnsaioMegazyme, Bray, Co. Wicklow, IrlandaK-BGLU
β-glucanosSetas y Hongos del Sur, S.L.Forneceu as quatro variantes de cogumelos
Waters 2695 Espectômetro de massa

Referências

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Beta-Glucano FúngicoPurificação de Beta-GlucanoImunoterapia do GlioblastomaAtivação de MicrogliaMicroambiente TumoralCromatografia de Exclusão MolecularCromatografia Líquida de Alta PerformanceInfravermelho com Transformada de FourierExtração de Polissacarídeos de CogumelosMeio Condicionado de Microglia
Isolamento e purificação de β-glucanas fúngicas como estratégia de imunoterapia para glioblastoma
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