Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

Summary

Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .

Abstract

A junção neuromuscular de Drosophila (NMJ) emergiu como um sistema modelo valioso no campo da neurociência. A aplicação da microscopia confocal no Drosophila NMJ permite que os pesquisadores adquiram informações sinápticas, abrangendo dados quantitativos sobre a abundância de sinapses e insights detalhados sobre sua morfologia. No entanto, a distribuição difusa e o alcance visual limitado do MET apresentam desafios para a análise ultraestrutural. Este estudo apresenta um método inovador e eficiente de preparação de amostras que supera a abordagem convencional. O procedimento começa com a colocação de uma malha de metal na base de uma garrafa de fundo plano ou tubo de ensaio, seguido pelo posicionamento de amostras de larvas fixas na malha. Uma malha adicional é colocada sobre as amostras, garantindo que elas sejam posicionadas entre as duas malhas. As amostras fixas são completamente desidratadas e infiltradas antes de prosseguir com o procedimento de incorporação. Em seguida, a inclusão das amostras em resina epóxi é realizada de forma plana, o que permite a preparação dos músculos para posicionamento e secção. Beneficiando-se dessas etapas, todos os músculos das larvas de Drosophila podem ser visualizados sob microscopia de luz, facilitando o posicionamento e seccionamento subsequentes. O excesso de resina é removido após a localização dos^6º e^7º músculos dos segmentos corporais A₂ e A₃. É realizada seccionamento ultrafino em série do^6º ou^7º músculo.

Introduction

A microscopia eletrônica é um dos métodos mais ideais para estudar a ultraestrutura de materiais biológicos que podem demonstrar visualmente e com precisão a estrutura interna das células no nível¹ em nanoescala. No entanto, devido à complexidade do processo de preparação da amostra e ao alto custo, a microscopia eletrônica não é tão popular quanto a microscopia de luz. Avanços recentes nas técnicas de microscopia eletrônica levaram a melhorias significativas na qualidade da imagem, coincidindo com uma redução notável na carga de trabalho associada. Consequentemente, a microscopia eletrônica tem assumido um papel importante no avanço do conheci....

Protocol

NOTA: O método de preparação de amostras de microscopia eletrônica de transmissão usado neste artigo foi relatado anteriormente¹⁶. É importante notar que a seleção de reagentes e o ajuste da dosagem são necessários dependendo da amostra. Existem muitos reagentes químicos tóxicos usados no processo de preparação da amostra, portanto, o operador precisa tomar certas medidas de proteção, como usar roupas e luvas de proteção e operar em uma capela de exaustão.

1. Procedimento de dissecação, fixação e colocação

1. Dissecção
   1. Disseque as larvas errantes do final do 3º instar em solução de Jan ....

Results

A parede corporal da larva de Drosophila é composta por 30 fibras musculares identificáveis dispostas em um padrão regular e se parece com uma fatia fina após a dissecção e fixação²¹ (Figura 1A). A amostra permanece plana durante o processo de desidratação devido à presença das malhas metálicas (Figura 1B, C). O músculo do corpo larval é enterrado em uma placa fina feita de resina epóxi (Figu.......

Discussion

As amostras de larvas de Drosophila tendem a se enrolar durante a desidratação, pois as amostras são finas, dificultando a localização precisa da junção neuromuscular, aumentando assim a dificuldade e a carga de trabalho para a preparação da amostra. A melhoria tradicional é encurtar a amostra⁷, mas as amostras ainda estavam enroladas em diferentes graus.

Em nosso método, existem duas etapas críticas: primeiro, as amostras permanecem planas durante todo o proce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Epoxipropano	SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD	JYJ 037-2015	Agente Penetrante
Drosophila Stocks	Bloomington	nenhum	As cepas de Drosophila de controle do tipo selvagem usadas nesta pesquisa foram todas W1118, e foram criadas de acordo com métodos de cultura padrão
Tubos de ensaio de vidro de fundo plano	Haimen Chenxing Experimental equipment Company	nenhum	Tubos de ensaio de vidro de fundo plano (garrafa) com plugue de esponja (ou tampa de garrafa)
Reticulador K4M	Agar Scientific	Cat# 1924B	As resinas de incorporação são baseadas em uma fórmula de acrilato e metacrilato altamente reticulada
Resina K4M (monômero B)	Lote da Agar Scientific	# 631557	Resina Monômero
Filme Polivinílico	Haimen Chenxing Experimental equipment Company	nenhum	filme de polietileno transparente é o melhor, espessura de cerca de 0,2 mm
SPI Chem DDSA	SPI	SpI # 02827-AF	Dodecenil Anidrido succínico
SPI-Chem DMP-30 Epóxi	SPI	02823-DA	Acelerador
SPI-Chem NMA	SPI	SpI # 02828-AF	Hardner para epóxi
SPI-PON 812 Epóxi		SPI SPI # 0259-AB	Monômero
de resinaMalha de aço	Yuhuiyuan Gardening Store(online)	none	Rede de cobre ou aço inoxidável
Microscopia eletrônica de transmissão	Hitachi H-7650	11416692	Todas as grades (nas quais as amostras foram coletadas) foram coradas com citrato de chumbo e observadas sob microscopia eletrônica de transmissão.
Micrótomo ultrafino	Leica UC7 micrótomo ultrafino	595915	Todas as operações de corte são realizadas em um micrótomo ultrafino Leica UC7 usando uma faca diamantada